不同因子對(duì)白腐真菌生長(zhǎng)的影響研究

王 敏

（阜陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236031）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，大豆秸稈、玉米秸稈和油菜秸稈在我國(guó)產(chǎn)量大，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的殘留物。阜陽(yáng)是重要的農(nóng)副產(chǎn)品生產(chǎn)基地，秸稈資源豐富。大豆、玉米和油菜等農(nóng)作物秸稈含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但其化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易被降解。因此，僅有少量用于生產(chǎn)紙張和飼料等行業(yè)，秸稈被隨意拋棄、放火焚燒秸稈現(xiàn)象依然很嚴(yán)重，影響人民的身體健康。這就會(huì)造成資源的浪費(fèi)，增大環(huán)境污染治理難度。隨著科學(xué)研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)可以采用物理和化學(xué)方法處理降解部分秸稈，但由于實(shí)際生產(chǎn)成本、操作和環(huán)境污染等原因，推廣使用范圍較小。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，秸稈中木質(zhì)素也可以利用微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。木質(zhì)素是一種大分子芳香族化合物。在木質(zhì)素降解方面，白腐菌被公認(rèn)是降解能力很強(qiáng)的微生物。胞外氧化酶的產(chǎn)生是降解木質(zhì)素的能力的基礎(chǔ)。木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)主要有過(guò)氧化物酶和漆酶構(gòu)成，其酶活性影響秸稈的降解程度。白腐真菌作為能降解木質(zhì)素的微生物，受到了人們的廣泛關(guān)注。

張芳芳研究表明，玉米秸稈可以通過(guò)白腐真菌被降解，同時(shí)白腐真菌還能用于對(duì)污染水體的生物修復(fù)。我們只有了解白腐真菌的生長(zhǎng)習(xí)性，才能充分發(fā)揮其作用，為環(huán)境的改善做出一定的作用。

白腐菌對(duì)秸稈的降解能力在很大程度上要依賴于培養(yǎng)條件。培養(yǎng)發(fā)酵的條件不同，降解秸稈能力也可能出現(xiàn)差異。內(nèi)外環(huán)境因素影響白腐真菌的生長(zhǎng)。培養(yǎng)基中碳氮源和金屬離子影響真菌代謝活動(dòng)，進(jìn)而影響真菌菌絲生長(zhǎng)及降解酶的分泌量。篩選出適合的培養(yǎng)基有利于提高酶活性，這是白腐真菌降解秸稈和污染物的基礎(chǔ)。香菇、杏鮑菇、平菇屬白腐真菌，本文通過(guò)培養(yǎng)基的優(yōu)化，觀測(cè)不同因子對(duì)白腐真菌的生長(zhǎng)及漆酶分泌的影響，對(duì)白腐真菌降解秸稈和污染水體的修復(fù)具有一定的意義。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種：平菇、香菇、杏鮑菇（學(xué)院選育）。

1.1.2 秸稈：玉米秸稈、大豆秸稈、油菜秸稈。

1.1.3 設(shè)備儀器：移液槍；高壓蒸汽滅菌器；高速離心機(jī)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；超凈工作臺(tái)；電熱恒溫水浴箱；分光光度計(jì)；粉碎機(jī)；電子天平。

1.1.4 活化和發(fā)酵培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基：用于菌種保存和活化。

液體種子基礎(chǔ)培養(yǎng)基：刨皮馬鈴薯100g，切成2cm左右方塊置于鍋中，加熱煮沸15min，用紗布將汁濾于大燒杯中，濾液補(bǔ)水到1L。在馬鈴薯濾汁中再分別加人20g葡萄糖、蛋白胨2g、NaH2PO41.5g、MgSO40.75g、酵母粉1.5g，混勻全部溶解后補(bǔ)水至1L，分裝于250mL 錐形瓶中，0.15MPa、121℃高壓滅菌25min。

秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆秸稈粉、玉米秸稈粉和油菜秸稈粉用以下1-6 種培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，添加秸稈粉量如下表1 所示。每種秸稈固體培養(yǎng)基中按表1 配方各加入20 克瓊脂。

表1 秸稈粉液體培養(yǎng)基配方

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基質(zhì)處理。秸稈取自阜陽(yáng)潁州區(qū)周邊農(nóng)家，選擇自然風(fēng)干的無(wú)霉變秸稈粉碎成0.5mm 顆粒，滅菌處理，備用。

1.2.2 菌種制備及深層培養(yǎng)方法。從斜面試管中將菌種接種在滅菌平板培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)定溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為8 天。待平板培養(yǎng)基菌絲占據(jù)1/2 平板后，用打孔器將直徑5mm 的接種物放入秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基1-6 中進(jìn)行試驗(yàn)，觀察各平板上菌絲生長(zhǎng)的均勻性。以菌絲體日平均生長(zhǎng)量和生長(zhǎng)勢(shì)為指標(biāo)，選擇了一種較好的液體深層培養(yǎng)基配方。

液體深層培養(yǎng)：菌絲體在平板上生長(zhǎng)后，取直徑5mm 的接種物，將五個(gè)接種塊放入添加大豆秸稈和油菜秸稈的培養(yǎng)基、碳源培養(yǎng)基和氮源培養(yǎng)基中，在無(wú)菌條件下，將五個(gè)接種塊放入每100ml 液體培養(yǎng)基中，并在28℃下以150r/min 的速度搖床12 天。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 菌絲體生物量的測(cè)定。發(fā)酵8 天后，用蒸餾水清洗真菌球上未過(guò)濾的秸稈粉，以每分鐘3000 轉(zhuǎn)的速度離心15 分鐘，然后置于65℃烘箱中干燥。用天平稱量其菌絲干重，把3 次平均值記作每種培養(yǎng)基的菌絲體干重量。通過(guò)菌絲體干重與培養(yǎng)基體積之比，計(jì)算出菌絲體生物量。

1.2.4 粗酶液的制備。在無(wú)菌條件下，每48 小時(shí)移取發(fā)酵液體。發(fā)酵液經(jīng)單層濾紙過(guò)濾后，以每分鐘4000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘，上清液為粗酶液。每個(gè)樣品分別取樣3 次。

1.2.5 漆酶(Lac)活性檢測(cè)。以3，3’-二甲基聯(lián)苯胺為底物，在比色皿中加入0.01mol L-1·的pH 值為4.0 醋酸鹽緩沖液3.4ml 和0.5ml 一定濃度的3，3-二甲基聯(lián)苯胺，混勻后加入0.1ml 稀釋酶溶液，檢測(cè)在25℃恒溫水箱反應(yīng)5min 時(shí)600nm 處吸光值。將樣品在沸水中煮15min 后酶液為對(duì)照，將單位時(shí)間內(nèi)吸光值的變化表示酶活變化。單位時(shí)間內(nèi)每毫升OD 值改變0.01，作為一個(gè)酶活單位。

2.結(jié)果與分析

2.1 不同配方對(duì)白腐真菌生長(zhǎng)的影響

表2 顯示了在液體培養(yǎng)基中添加不同量的秸稈粉培養(yǎng)條件下，對(duì)白腐真菌菌絲體均勻度和菌絲體生物量的影響。

表2 白腐真菌在不同培養(yǎng)液條件下的培養(yǎng)結(jié)果

本次研究中，主要抽選了大豆秸稈、油菜秸稈、玉米秸稈作為白腐真菌培養(yǎng)的基質(zhì)。通過(guò)表2 可知，試驗(yàn)所選的3 種秸稈粉添加量均有利于白腐真菌菌絲生長(zhǎng)，尤其是當(dāng)添加20g/L 大豆秸稈和20g/L 油菜秸稈培養(yǎng)基時(shí)，菌絲生物量是對(duì)照組的三倍。處理5 的菌絲生物量最大，培養(yǎng)后菌絲球大小均勻。處理5 的菌絲生物量與其他處理顯著不同。綜合分析表明，處理5 更適合三種白腐菌的液體培養(yǎng)。后期液體發(fā)酵培養(yǎng)基選用處理5 配方。

由上述實(shí)驗(yàn)表明，在白腐真菌生長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)加入一定量的秸稈粉，能為其生長(zhǎng)提供所需的養(yǎng)分，對(duì)白腐真菌的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，從而使白腐真菌能夠更加快速的生長(zhǎng)。白腐真菌在不同秸稈中生長(zhǎng)狀況的差異，可能是由于不同的秸稈中所含的營(yíng)養(yǎng)成分不同。

2.2 碳源對(duì)白腐真菌分泌漆酶的影響

碳源是真菌的碳骨架和能量來(lái)源。限制碳源不利于微生物的生長(zhǎng)。碳源在真菌的生長(zhǎng)中起著非常重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究了不同碳源對(duì)白腐菌生長(zhǎng)的影響。以尿素為氮源，用5 個(gè)2%的碳源代替基本培養(yǎng)基中的葡萄糖。以蔗糖、可溶性淀粉、麩皮、纖維素和玉米粉為碳源，置于28℃培養(yǎng)，并于第12 天取樣測(cè)定漆酶活性。

結(jié)果表明，在選擇的碳源中，麩皮為碳源時(shí)漆酶活性最高，其次為纖維素和葡萄糖。麥麩中含有豐富的纖維素、木質(zhì)素、維生素等物質(zhì)，在平菇、香菇、杏鮑菇培養(yǎng)基中添加一定量的麩皮，能促進(jìn)漆酶的分泌。這可能是由于木質(zhì)素能作為漆酶的誘導(dǎo)劑，在一定程度上促進(jìn)了漆酶的產(chǎn)生。因此，在培養(yǎng)過(guò)程中可以看到添加麩皮的培養(yǎng)基中漆酶活性較高。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，麥麩是平菇、香菇、杏鮑菇產(chǎn)生漆酶的較好碳源。

2.3 氮源對(duì)白腐真菌分泌漆酶的影響

本次實(shí)驗(yàn)以尿素、硫酸銨、硝酸銨、酒石酸銨、酵母浸膏為不同氮源，觀測(cè)香菇、平菇、杏鮑菇在不同氮源作用下的生長(zhǎng)情況。三種白腐真菌在各種氮源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到12 天時(shí)進(jìn)行漆酶活性測(cè)定。氮源培養(yǎng)基以麩皮為碳源。

圖2 中顯示，在試驗(yàn)選定的幾種氮源中，當(dāng)酵母抽提物為氮源時(shí)，香菇、平菇、杏鮑菇漆酶活力都達(dá)到較高值，若選NH4NO3為氮源時(shí)漆酶活力較差，這表明酵母抽提物可以作為最適合酶生產(chǎn)的氮源，酒石酸銨和蛋白胨也是較好的氮源，產(chǎn)生的酶活性與酵母抽提物差距不明顯。氮源的消耗直接影響木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生，木質(zhì)素降解酶是一種次生代謝酶。在自然狀態(tài)下，通常在氮源耗盡時(shí)產(chǎn)生。

2.4 銅離子對(duì)白腐真菌分泌漆酶的影響

漆酶的活性中心是由四個(gè)銅離子組成。銅作為漆酶蛋白的重要結(jié)構(gòu)成分，不僅影響漆酶的活性和穩(wěn)定性，而且是誘導(dǎo)漆酶產(chǎn)生的重要因素。

如圖3 所示，銅離子添加一定量，能提高漆酶活性，濃度增至50mg/L 以上時(shí)，會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橐种破崦负铣?。?dāng)Cu2+在20～40mg/L 濃度范圍時(shí)，酶活性與對(duì)照相差不明顯。這可能是因?yàn)榈蜐舛葧r(shí)Cu2+只與酶表層附近的基團(tuán)有結(jié)合作用，幾乎對(duì)漆酶的結(jié)構(gòu)沒(méi)什么影響，對(duì)漆酶內(nèi)部呼吸鏈傳遞影響不大，使得激活效果不明顯。

當(dāng)Cu2+在50mg/L 時(shí)，香菇、平菇、杏鮑菇的漆酶活性相對(duì)較高。當(dāng)Cu2+濃度超過(guò)50mg/L 時(shí)，這三種菌株漆酶活性反而降低了。這可能是由于酶的活性中心結(jié)合點(diǎn)被飽和，高濃度的Cu2+與酶的活性中心外的結(jié)合點(diǎn)增多，過(guò)多的結(jié)合點(diǎn)也會(huì)改變酶的結(jié)構(gòu)，影響電子傳遞，出現(xiàn)漆酶從高活性狀態(tài)激活變?yōu)榈突钚裕S著底物消耗，酶活性出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。銅缺乏和銅限制不利于漆酶的合成。Cu2+可能通過(guò)與漆酶中的酸性氨基酸殘基相互作用或通過(guò)影響漆酶的電荷平衡來(lái)影響漆酶活性。這可能是由于漆酶基因的轉(zhuǎn)錄需要銅離子來(lái)合成蛋白質(zhì)。

3.討論

本實(shí)驗(yàn)研究中分別選擇6 種不同的碳源和氮源，考察對(duì)漆酶活性影響。試驗(yàn)表明，同一種酶在不同營(yíng)養(yǎng)條件下其活性不同。在不同培養(yǎng)條件下，香菇、平菇、杏鮑菇分泌的漆酶活性也有差異，一方面可能是由于不同菌株具有生理上差異，另一方面可能是不同的培養(yǎng)體系對(duì)不同菌株木質(zhì)素降解酶的分泌影響不同。因此，合理的物質(zhì)配比對(duì)白腐菌的生長(zhǎng)和木質(zhì)素降解酶的分泌有著決定性的影響。

不同的因子影響著白腐真菌的不同方面，其中較為重要的就是培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是白腐真菌得以生存發(fā)展的基礎(chǔ)，培養(yǎng)基質(zhì)、碳源、氮源、金屬離子等都對(duì)白腐真菌的生長(zhǎng)有一定的影響，只有研究好白腐真菌的影響因素，才能更好的培育白腐真菌，使之運(yùn)用到更加廣泛、更需要的環(huán)境之中。木屑、腐爛的樹(shù)枝、農(nóng)業(yè)廢棄物等都可以作為白腐真菌培養(yǎng)的原料，我們可以充分利用白腐真菌培養(yǎng)的容易性，對(duì)白腐真菌進(jìn)行培養(yǎng)，使白腐真菌能更多的為保護(hù)環(huán)境而做出努力。