細胞因子IL-17A對成牙骨質(zhì)細胞增殖、分化及礦化影響的實驗研究

胡熹，羅俊

（1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，南昌330000；2.南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科江西省口腔生物醫(yī)學(xué)重點實驗室江西省口腔疾病臨床研究中心，南昌330000）

牙根吸收是臨床正畸治療過程中一種常見的并發(fā)癥[1-2]，近年來已成為正畸醫(yī)生關(guān)注的熱點問題之一。有學(xué)者對牙根吸收的諸多因素進行歸納，包括性別、年齡、牙齒的移動方式、牙髓活力、牙根長度和牙冠的根冠比，牙槽骨的皮質(zhì)厚度等[3-6]；也有學(xué)者對牙根吸收相關(guān)的分子學(xué)進行了大量的基礎(chǔ)實驗研究，如:Th1、Th2相關(guān)細胞因子（TNF-α,IL-6，GM-CSF）以及其他細胞因子(骨保護素、整合素αvβ3、一氧化氮、各種蛋白酶等)的研究[7-8]。白介素17（IL-17）家族是一組由輔助性T細胞產(chǎn)生的促炎性細胞因子。 IL-17家族成員不僅參與組織的免疫反應(yīng)，而且還參與骨代謝。盡管已有廣泛研究IL-17在破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收中的作用[9]，但很少研究其在成骨細胞介導(dǎo)的骨形成中的作用。本研究擬觀察IL-17A對成牙骨質(zhì)細胞OCCM30增殖、分化及礦化的影響；探討IL-17A對正畸力致牙根吸收骨代謝過程中的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 白介素17（美國Peprotech公司），成牙骨質(zhì)細胞株OCCM-30（四川大學(xué)贈送），CO2恒溫培養(yǎng)箱，酶聯(lián)免疫檢測儀，離心機，倒置光學(xué)顯微鏡，MTT粉劑（Amresco公司），茜素紅，DMEM/F12（Hyclone，美國)，胎牛血清(FBS，Hyclone，美國)，胰酶-EDTA消化液（Solarbio公司），二甲基亞砜(DMSO，Solarbio公司），β-膦酸甘油，哺乳動物蛋白抽提試劑（康為世紀），西砒氯銨。

1.2 實驗方法

1.2.1 OCCM-30的培養(yǎng) 將OCCM-30按1×105個/瓶培養(yǎng)于50 mL細胞培養(yǎng)瓶，加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2，95%空氣)中培養(yǎng)，每天換液。倒置顯微鏡下觀察細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%時即可開始按1∶3傳代，傳代后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液。

1.2.2 不同濃度IL-17A對OCCM-30增殖的影響采用噻唑藍比色試驗。取對數(shù)生長期細胞，制備密度為1×104/mL OCCM-30單細胞懸液，接種于96孔板，對照組和IL-17A組共計6組，每組6復(fù)孔。觀察細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液及未貼壁細胞，實驗組分別用含10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL IL-17A的培養(yǎng)液處理細胞，對照組使用不含IL-17A的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，進行MTT分析。每孔加入20μL 5.0 mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4 h，加入150μL的DMSO，低速振蕩15 min，設(shè)立空白對照孔(不含細胞)以進行調(diào)零，用酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm波長處測其吸光度(optical density，OD值)。

1.2.3 不同濃度IL-17A作用下OCCM-30內(nèi)ALP活性檢測 將OCCM-30細胞以2×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板，對照組和IL-17A組共計6組，每組6復(fù)孔，置于CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，倒置顯微鏡觀察細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液及未貼壁細胞，對照組加含10%FBS的DMEM/F12，IL-17A組中分別加入含10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL IL-17A的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入哺乳動物蛋白抽提試劑100μL，冰上孵育20 min，并用槍頭吹打貼壁細胞，將裂解液轉(zhuǎn)移至EP離心管中，14,000 rpm離心20 min，取上清50 μL種于96孔培養(yǎng)板中，用ALP試劑盒做酶聯(lián)免疫吸附試驗（Elisa）。

1.2.4 不同濃度IL-17A作用下OCCM-30形成礦化結(jié)節(jié)含量測定 采用茜素紅染色法。將細胞消化計數(shù)，按每孔5×104個/mL細胞濃度接種于24孔板，每孔500μL，每種濃度重復(fù)6孔，對照組加入礦化培養(yǎng)基DMEM/F12（含10%FBS、抗壞血酸50 μg/mL、10 mmol/L B-磷酸甘油鈉），IL-17A組中分別加入含10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL IL-17A礦化培養(yǎng)基。7 d后可見礦化結(jié)節(jié)形成吸去培養(yǎng)液，PBS沖洗，用4%多聚甲醛原位固定10 min，0.1%茜素紅（0.1 g茜素紅，溶于0.1 M的tris-Hcl 100 mL中，調(diào)節(jié)PH為8.3）染色30 min，吸去染液，用PBS洗去浮色，加入10%西砒氯銨，室溫放置20 min，用酶標儀在570 nm處測定OD值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度IL-17A對OCCM-30增殖的抑制作用IL-17A作用OCCM-30細胞24 h后，不同濃度的藥物干擾實驗組OCCM-30細胞活力與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而在IL-17A作用48 h和72 h后，OCCM-30細胞活力呈濃度依賴性地降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

結(jié)果顯示，IL-17A對OCCM-30細胞增殖的抑制作用隨時間的延長而增加，細胞毒性呈時間和濃度劑量反應(yīng)關(guān)系，見表1、2。

表1 不同濃度IL-17A作用下OCCM-30吸光度值

2.2 Elisa定量檢測堿性磷酸酶（ALP）活性結(jié)果顯示 不同濃度IL-17A作用于OCCM-30 48 h后，實驗組ALP活性較對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果表明，IL-17A濃度為10 ng/mL至30 ng/mL成梯度降低，30 ng/mL以上ALP活性維持較低水平。

2.3 不同濃度IL-17A作用下OCCM-30形成礦化結(jié)節(jié)含量測定 OCCM-30貼壁后呈對數(shù)增長，待細胞長滿后聚集成灶（圖1），分泌骨基質(zhì)礦化，形成礦化結(jié)節(jié)(圖2、圖3)。由圖3所示，與對照組相比，不同濃度IL-17A作用于OCCM-30形成礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)濃度依賴性降低。濃度為30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL的IL-17A明顯抑制礦化結(jié)節(jié)的生成，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 成牙骨質(zhì)細胞occm-30貼壁后4 d

圖2 典型礦化結(jié)節(jié)染色

圖3 礦化結(jié)節(jié)聚集成灶

表2 不同濃度IL-17A作用于OCCM-30細胞48 h后ALP活力改變

3 討論

牙根吸收是臨床正畸治療過程中常見的并發(fā)癥之一，有學(xué)者認為幾乎所有的正畸患者都存在某種程度的牙根吸收，其發(fā)生率在3%～100%[10]。破牙骨質(zhì)細胞是負責牙齒硬組織吸收的多核細胞，在形態(tài)和功能上均與破骨細胞相似。破骨細胞是正常骨結(jié)構(gòu)的一部分，在生理條件下，破牙骨質(zhì)細胞在牙骨質(zhì)或牙根表面很少見[11]。它們存在于根吸收表面。牙根吸收是一個非常復(fù)雜的過程，主要作用細胞為破骨細胞和破牙骨質(zhì)細胞。而成牙骨質(zhì)細胞具有抗吸收特性，在抵御外界刺激、防止牙根外吸收的過程中發(fā)揮著重要作用[12]。

3.1 Th17細胞及其相關(guān)細胞因子IL-17A的研究在正畸力作用下，齦溝液內(nèi)各種細胞因子參與了細胞內(nèi)牙周組織改建[13-14]。在骨吸收過程中，T細胞對成骨細胞和破骨細胞有刺激和抑制作用，它可通過產(chǎn)生正負調(diào)節(jié)因子而影響骨代謝，這種作用與T細胞亞群、細胞因子的類別和局部因素密切相關(guān)。

Th17細胞是CD4+T細胞亞群，它的發(fā)現(xiàn)起源于實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)的研究。Thl7細胞產(chǎn)生的細胞因子主要有IL-17A(IL-17)和IL-17F、IL-22；這些細胞因子廣泛參與全身免疫系統(tǒng)性疾病的調(diào)節(jié)。IL-17A是IL-17家族(IL-17A-F)中的重要成員，也是Th17的記憶T細胞亞群主要的細胞因子[15]。

3.2 IL-17A在正畸力致牙根吸收中作用的可能性機制 牙骨質(zhì)缺損是炎癥性外吸收發(fā)生的前提，體外研究發(fā)現(xiàn)，牙骨質(zhì)細胞也可表達骨保護蛋白（OPG）和核因子-KB受體活化因子配體（RANKL）mRNA，且相對于骨細胞，其OPG的表達量更高，而RANKL的表達量更低，使得表達的OPG/RANKL比例較高，牙周膜細胞可以通過調(diào)節(jié)OPG-RANKL-RANK軸來影響成牙骨質(zhì)細胞的形成[16]。有學(xué)者建立了類風濕病關(guān)節(jié)病動物模型，發(fā)現(xiàn)IL-17A不僅可抑制成骨細胞的增殖、分化，還可增加小鼠顱頂成骨細胞中RANKL的表達[17]。本實驗結(jié)果顯示，IL-17A能顯著抑制體外培養(yǎng)OCCM-30的增殖，并且具有高度依賴性。在24 h時藥物對OCCM-30增殖無明顯影響，從48 h開始出現(xiàn)抑制作用，并呈時間依賴性。本實驗中，不同濃度的IL-17A作用于OCCM-30細胞48 h后，其ALP活性有顯著差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

本實驗結(jié)果顯示，IL-17A在濃度為30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL時明顯抑制礦化結(jié)節(jié)的生成，且形成礦化結(jié)節(jié)量無明顯變化。成骨細胞需要28天左右形成明顯礦化結(jié)節(jié)，而本實驗中，OCCM-30僅需7 d即形成明顯礦化結(jié)節(jié)。成牙骨質(zhì)細胞迅速礦化的原因可能是細胞內(nèi)外骨涎蛋白、OCN等礦化相關(guān)蛋白表達強烈，而成骨細胞表達的相關(guān)礦化蛋白相對微量。IL-17對成骨細胞分化的調(diào)節(jié)也能起到影響骨礦化的作用，通過促進成熟成骨細胞分化，從而為細胞礦化提供有利條件[18]。

綜上所述，IL-17A抑制成牙骨質(zhì)細胞增殖、分化及礦化，本實驗在細胞水平上探討IL-17A是否參與了正畸性牙根吸收，為IL-17A影響牙根吸收提供部分實驗基礎(chǔ)。