表皮生長因子甲基化與肺腺癌細胞對吉非替尼耐藥的相關性研究

郭玲玲，何蕾，段鳳英

（1.南昌大學附屬人民醫院呼吸內科；2.南昌大學第二附屬醫院呼吸內科，南昌330006）

2018 年有報告[1]顯示肺癌是中國以及全世界發病率和死亡率最高的癌種。非小細胞肺癌占肺癌85%左右。多數非小細胞肺癌在確診時已經喪失手術機會，目前的放化療效果有限，且不良反應較大[2]。隨著越來越多的肺癌驅動基因被發現，精準治療是目前及未來肺癌治療的方向。以吉非替尼、厄洛替尼為代表的表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑（Epidermal Growth Factor Receptor-tyrosine Kinase Inhibitors,EGFR-TKIs）是目前成功運用于非小細胞肺癌的分子靶向藥物[3]。已被指南推薦應用于存在EGFR敏感突變的非小細胞肺癌的一線治療，但隨后發現的繼發性和原發性耐藥降低了其臨床療效[4]。

目前臨床上多采用檢測EGFR的突變來預測肺癌對EGFR-TKIs的敏感性。存在EGFR基因敏感突變的非小細胞肺癌對TKIs的敏感性達75%（多為19外顯子的缺失及21外顯子的L858R點突變），但在治療的過程中或者治療后大多數會發生繼發性耐藥。而大多數EGFR野生型非小細胞肺癌對EGFR-TKIs原發性耐藥，但臨床上仍發現大約10%的EGFR野生型的非小細胞肺癌對EGFR-TKIs敏感，另外有小部分存在EGFR敏感突變的非小細胞肺癌對EGFR-TKIs耐藥[5-6]。這表明EGFR突變狀態不是評價非小細胞肺癌對EGFR-TKIs是否耐藥的唯一指標。越來越多的研究發現表觀遺傳學的甲基化參與了TKIs的耐藥。本課題擬探討EGFR基因啟動子甲基化在肺腺癌細胞對吉非替尼原發及繼發性耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料試劑 肺腺癌細胞株購自上海肺癌研究所：H1299(對吉非替尼原發耐藥)，H1975(T790M突變，對吉非替尼繼發耐藥)，HCC827（19外顯子敏感突變，對吉非替尼敏感）；RPMI1640細胞培養液，10%胎牛血清購自美國Gibco公司；5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-CdR)購自美國sigma公司；吉非替尼粉劑購自大連美侖生物技術有限公司，溶解于DMSO，制成實驗相應濃度1000倍的溶液，分裝保存于-20℃冰箱中備用，實驗時用培養液稀釋至目標濃度，使終溶液中DMSO體積分數低于0.1%。CCK8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自Biosharp公司；重亞硫酸鹽DNA甲基化試劑盒購自Qiagen公司；DNA提取試劑盒購自上海天根化工有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 肺腺癌細胞株H1299、H1975、HCC827采用含有10%胎牛血清RPMI1640細胞培養液，于37℃培養箱中培養，次日換液，繼續培養，每兩天換液1次，待長滿培養瓶后消化傳代，待傳到第3代，對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 甲基化檢測 肺腺癌細胞株H1299、H1975、HCC827培養至對數生長期后隨機分為兩組：A組：對照組（不加5-aza-CdR），B組：試驗組（加入1μmol/L 5-aza-CdR處理），在第24 h、48 h、72 h 0.25%胰酶消化收集各組細胞，提區細胞DNA，進行甲基化修飾，之后根據MSP試劑盒的流程進行各組細胞EGFR甲基化的檢測。EGFR甲基化引物:正義鏈TGTTTTTTCGCGTTTCGGTTCGCGC；反義鏈：CGTCTAAACGACGACGACCGCCG；產物150 bp；EGFR非甲基化引物：正義鏈：TGTTTTGTTTTT TTGTGTTTTGGTTTGTGT；反義鏈：CATCCAATCTA AACAACAACAACCACCA；產物150 bp。將PCR產物電泳，根據條帶亮度，判斷3組細胞5-aza-CdR的最佳去甲基化時間。

1.2.3 CCK-8測增殖抑制率 培養肺腺癌細胞株H1299、H1975、HCC827，至對數生長期后隨機分為兩組。A組：對照組（不加任何藥物）；B組:5-aza-CdR組（加入1μmol/L 5-aza-CdR，處理時間為最佳的去甲基化時間72 h）；C組：吉非替尼組（加入1μmol/L的吉非替尼，作用時間同72 h）；D組：聯合處理組（1μmol/L 5-aza-CdR加1μmol/L的吉非替尼）；采用CCK-8方法測各組細胞的增殖抑制率。

1.2.4 流式細胞技術測細胞凋亡率 分別取處于對數生長期，生長狀態良好的H1299，H1975和HCC827細胞，用1640培養基調整細胞密度到3×105/mL，接入6孔板，每孔1 mL細胞懸液，37℃培養過夜；對細胞進行分組，A組：正常對照組；B組：吉非替尼處理組（加入的1μmol/L的吉非替尼）；C組：5-aza-CdR處理組（加入1μmol/L的5-aza-CdR）；D組：吉非替尼+5-aza-CdR聯合處理組（加入1μmol/L吉非替尼和1μmol/L 5-aza-CdR）作用時間：72 h，收集細胞，1200 rpm，5 min離心，去上清，加PBS重懸細胞，按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒操作說明進行檢測四組細胞的凋亡率。

2 結果

2.1 甲基化特異性PCR檢測 H1299細胞（EGFR野生型，對吉非替尼原發耐藥）EGFR啟動子是高甲基化，給予5-aza-CdR處理的最佳去甲基化時間為72 h（見圖1）；H1975細胞（T790M突變，對吉非替尼獲得性耐藥）EGFR啟動子為部分甲基化，甲基化程度低于原發耐藥的H1299細胞，給予5-aza-CdR處理的最佳去甲基化時間為72 h（見圖2）；HCC827細胞（19外顯子缺失突變，對吉非替尼敏感）EGFR啟動子為非甲基化的，給予5-aza-CdR處理其啟動子仍為非甲基化（見圖3）。

圖1 為H1299EGFR啟動子MSP結果：1.A組24 h M；2.A組24 h U；3.B組24 h M；4.B組24 h U；5.A組48 h M；6.A組48 h U；7.B組48 h M；8.B組48 h U；9.A組72 h M；10.A組72 h U；11.B組72 h M；12.B組72 h U；M：DL2000Ma rk（A組為對照組：不加任何藥物；B組為5-a za-Cd R組：加入1μmol/L 5-a za-Cd R；M代表甲基化；U代表非甲基化）。

圖2 為H1975EGFR啟動子MSP結果：1.A組24 h M；2.A組24 h U；3.B組24 h M；4.B組24 h U；5.A組48 h M；6.A組48 h U；7.B組48 h M；8.B組48 h U；9.A組72 h M；10.A組72 h U；11.B組72 h M；12.B組72 h U；M：DL2000Ma rk（A組為對照組：不加任何藥物；B組為5-a za-CdR組：加入1μmol/L 5-a za-Cd R；M代表甲基化；U代表非甲基化）。

圖3 為HCC827細胞EGFR啟動子MSP結果標注（A組為對照組：不加任何藥物；B組為5-a za-Cd R組：加入1μmol/L 5-a za-Cd R；M代表甲基化；U代表非甲基化）：1.A組24 h M；2.A組24 h U；3.B組24 h M；4.B組24 h U；5.A組48 h M；6.A組48 h U；7.B組48 h M；8.B組48 h U；9.A組72 h M；10.A組72 h U；11.B組72 h M；12.B組72 h U；M：DL2000Ma rk。

2.2 CCK-8測各組細胞的增殖抑制率 1μmol/L的5-aza-CdR和1μmol/L吉非替尼分別及聯合處理H1299、H1975、HCC827細胞，72 h后CCK方法測定各組細胞的增殖抑制率，見表1。

表1 CCK方法測各組細胞的增殖抑制率（%）

2.3 流式細胞技術測細胞凋亡率 按照AnnexinVFITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒操作說明進行操作測各組細胞的凋亡率，見表2。

3 討論

甲基化是表觀遺傳學的常見形式。DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶(DNA Methyltrans--ferase DNMTs)的催化下由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基將之轉移到DNA的5’-胞嘧啶使之轉變為5’-甲基胞嘧啶的過程[7]。越來越多的研究證實甲基化參與了許多基因的表達、轉錄，與多種藥物的耐藥相

關[8-9]。

目前已經證實部分肺腺癌患者的EGFR啟動子存在著不同程度的甲基化。且臨床發現單純依靠EGFR基因突變的檢測來預測肺腺癌患者是否對EGFR-TKIs敏感，存在一定的失敗率。那么EGFR甲基化是否與肺腺癌對EGFR-TKIs的耐藥相關，成為解決EGFR-TKIs耐藥問題的一個突破點。強少盈等[10]通過檢測肺癌術后病理標本發現EGFR敏感突變的肺癌患者均未發現甲基化，相反，未檢測出敏感突變的肺癌標本存在較高的甲基化率，EGFR啟動子的甲基化與EGFR突變之間存在明顯相關性。孫俊杰等[11]研究6個不同的非小細胞肺癌細胞株，研究結果顯示，同為19外顯子敏感性突變，HCC827細胞對吉非替尼敏感，H1650細胞對吉非替尼不敏感；同為EGFR野生型，H358細胞較H1299、A549細胞對吉非替尼更敏感，甚至其敏感性超過19外顯子突變的H1650細胞。隨后作者通過甲基化特異性PCR、RT-PCR及Westernbolt檢測發現EGFR基因啟動子區高甲基化可以下調EGFR基因mRNA及蛋白的表達水平，從而有可能降低非小細胞肺癌對EGFR-TKIs（如吉非替尼）的敏感性，所以作者認為EGFR基因啟動子甲基化可能參與了肺癌細胞對EGFR-TKIs的耐藥。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-CdR)是DNA甲基轉移酶抑制劑，它能夠抑制甲基轉移酶的活性從而使DNA甲基化水平降低，從而使轉錄失活的基因再表達。那么5-aza-CdR能否降低腫瘤細胞EGFR啟動子甲基化，從而提高EGFR基因的表達，改善腫瘤對EGFR-TKIs的耐藥。早在2006年Alerto J[12]曾在乳腺癌細胞株CAMA1和MB453中發現其EGFR啟動子區CpG甲基化分別為90%和30%～50%，作者采用RT-PCR及Western-blot分別檢測正常乳腺細胞株及EGFR啟動子非甲基化的和甲基化的細胞株，發現EGFR啟動子甲基化的細胞株存在EGFRmRNA及蛋白水平的低表達或者不表達。接著作者采用甲基化轉移酶抑制劑地西他濱作用于兩個細胞株，72 h后，RT-PCR顯示EGFR的mRNA表達增加。乳腺癌細胞株CAMA1和MB453均對EGFR-TKI藥物吉非替尼相對耐藥，采用地西他濱及吉非替尼聯合處理后細胞凋亡增加，所以作者認為甲基化轉移酶抑制劑和吉非替尼有協同作用。 遺憾的是國外沒有甲基化轉移酶抑制劑和EGFR-TKIs聯合處理在肺癌中的研究，國內僅有2013年Li XY等[13]研究分別及聯合采用吉非替尼及5-aza-CdR處理三個非小細胞肺癌細胞系H1650、H1299、PC-9，并采用甲基化特異性PCR（MSP）檢測其EGFR啟動子甲基化水平，結果發現EGFR啟動子為非甲基化的PC-9對吉非替尼敏感，EGFR啟動子高甲基化的H1650、H1299對吉非替尼耐藥，之后使用5-aza-CdR逆轉EGFR啟動子高甲基化后可以提高吉非替尼對腫瘤細胞的抑制作用，誘導細胞凋亡。因此作者認為EGFR啟動子高甲基化可能與非小細胞肺癌對TKIs耐藥有關，降低EGFR甲基化也許可以逆轉肺癌細胞對TKIs的耐藥。徐姝等[14]采用采用甲基化轉移酶抑制劑5-氮雜胞苷及吉非替尼分別及聯合處理非小細胞肺癌細胞株H1650和H1299，發現聯合處理組細胞的EGFR表達增加，細胞的凋亡增加。胡成平等[15]發現吉非替尼敏感細胞株PC9和耐藥細胞株PC9/GR的EGFR啟動子甲基化分別為59%和74%，但RT-PCR檢測發現PC9/GR的EGFRmRNA表達水平高于PC9細胞，這與之前的多數研究不相符，可能表明甲基化不是影響EGFRmRNA表達的唯一原因，但是具體機制不太清楚。

那么EGFR啟動子甲基化是否與肺腺癌細胞對吉非替尼原發性耐藥及繼發性耐藥均相關，在原發性和繼發性耐藥中有無區別，以及EGFR啟動子去甲基化后是否可以逆轉肺癌細胞對吉非替尼的耐藥呢？本研究采用甲基化轉移酶抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-CdR)及吉非替尼，分別及聯合處理肺腺癌細胞株H1299(原發耐藥),H1975(T790M突變，繼發耐藥),HCC827（19外顯子敏感突變）。通過甲基化特異性PCR檢測發現原發性耐藥的H1299細胞EGFR啟動子存在高甲基化，繼發性耐藥的H1975細胞EGFR啟動子為部分甲基化，甲基化程度低于原發耐藥的H1299細胞。存在敏感突變的HCC827細胞EGFR啟動子為非甲基化的，提示甲基化可能參與了肺腺癌細胞對吉非替尼的耐藥，通過CCK-8法測定發現吉非替尼聯合5-aza-CdR可以明顯抑制肺腺癌細胞的增殖。進一步分析吉非替尼聯合5-aza-CdR在改善肺腺癌細胞對EGFR-TKIs原發性及繼發性耐藥中區別，發現二者聯合可以更好的抑制原發性耐藥的H1299細胞的增殖，與繼發性耐藥相比差異具有統計學意義。采用流式細胞技術檢測各組細胞凋亡率，發現聯合治療組可以促進H1299，H1975及HCC827三組細胞的凋亡，與單用吉非替尼組相比，差異有統計學意義。但三組之間差異無統計學意義。

總之本研究證實EGFR啟動子區高甲基化可能參與了肺腺癌細胞對吉非替尼的原發性和繼發性耐藥。對EGFR基因啟動子甲基化檢測可能對預測肺腺癌對吉非替尼的療效有一定的指導意義。5-aza-CdR聯合吉非替尼可以部分改善肺腺癌細胞對吉非替尼的耐藥，為未來解決肺腺癌對EGFR-TKIs耐藥提供新的研發思路。