妊娠期肝內膽汁淤積癥孕婦胎盤ABCB4基因表達與妊娠結局的關系

趙臨瀟，左博云，李靜亞，于東升

1.延安大學咸陽醫院病理科，陜西 咸陽 712000；

2.洛陽市婦幼保健院病理科，河南 洛陽 471000

妊娠期肝內膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)多于妊娠末3個月發生，臨床主要表現為皮膚瘙癢、黃疸，孕婦血清膽汁酸水平明顯升高，與此同時血清膽紅素、轉氨酶、堿性磷酸酶等也有輕度的增高，并在生產后癥狀迅速消失，實驗室指標恢復正常，再次妊娠后可復發[1-2]。ICP孕婦預后往往較好，但可導致早產、胎兒窘迫等一系列胎兒新生兒不良后果，增加圍生兒疾病發生率和死亡率，被列為高危妊娠之一[3]。近年來，有研究認為轉運體編碼基因ABCB4上的突變可能和ICP 的發生關系密切[4]。本研究分析ICP孕婦胎盤組織ABCB4基因表達水平變化，探討其與妊娠結局的關系，旨在為疾病的防治提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2020年11月于延安大學咸陽醫院分娩的98 例ICP 孕婦納入ICP組，年齡21～39歲，平均(28.03±3.43)歲；孕次1～4次，平均(2.13±0.57)次；初產婦77例，經產婦21例；發病時孕周≤34 周者19 例，＞34 周者79 例；按照血清總膽汁酸水平將＜40 mol/L 者納入輕度組(n=61)，將≥40 mol/L者納入重度組(n=37)。納入標準：(1)符合中華醫學會婦產科學分會ICP診斷標準[5]；(2)年齡≥20歲；(3)單胎妊娠。排除標準：(1)子宮先天畸形、胎位不正；(2)長期生殖道用藥；(3)輔助生殖或促排卵受孕；(4)合并免疫或血液系統疾??；(5)合并高血壓、糖尿病、甲狀腺疾病、慢性腎炎等；(6)合并嚴重心、腎、肺等臟器疾病；(7)臨床資料不全。另選取健康孕婦50例納入對照組，年齡22～39 歲，平均(28.19±3.29)歲；孕次1～4 次，平均(1.84±0.29)次。ICP組與對照組孕婦的年齡、孕次比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，孕婦及家屬知情同意。

1.2 方法 娩出胎盤15 min內采集標本，取母體面中央位置，去掉底部的蛻膜層，取約1 cm×1 cm×1 cm大小的胎盤組織塊，注意避開異常組織(例如梗死區、鈣化灶、出血處)，10%甲醛固定，采用反轉錄聚合酶鏈式擴增(RT-PCR)法測定ABCB4 mRNA 表達水平，以免疫組化法測定ABCB4蛋白表達水平。

1.2.1 ABCB4 mRNA 檢測 通過RT-PCR 法，生理鹽水洗滌冷凍胎盤組織至無血色，剪碎置于勻漿器，提取總RNA。取2 μg總RNA逆轉錄酶進行cDNA合成，使用美國7300 實時PCR 系統。內參β-actin 引物 序 列：上 游 引 物5′-CACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游引物5′-TCA GGAGGAGCAATGAT CTTG-3′；ABCB4 引物序列：上游引物5′-CTGCTGGAAAGATTGCAACAG-3′，下游引物5′-GAGCAAAT GAACTCGCATGTC-3′。反應體系及條件：10×PCR緩沖液2.5 μL，d NTP 混合物0.5 μL，10×PCR 緩沖液0.5 μL，上下游引物各0.5 μL；95℃孵育30 s后開啟循環：95℃變性(15 s)、60℃退火(20 s)、70℃延伸(10 s)，共40 個循環。測定ABCB4 mRNA 灰度，以β-actin 灰度值作為對照，獲得相對量。

1.2.2 ABCB4 蛋白檢測 標本4 μm 厚連續切片，脫蠟，梯度酒精脫水，0.01 mol/L 檸檬酸鈉抗原修復，室溫下3%過氧化氫(H2O2)阻斷10 min，磷酸鹽平衡生理鹽水(PBS)清洗(3 次) 10%的牛血清白蛋白(BSA)浸潤，室溫下孵育5 min，封閉非特異性位點，加一抗，4℃孵育過夜，PBS清洗(3次)。滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記P 物質(SP)，37℃孵育，時長為30 min，PBS清洗3 次，DAB顯色10 min，PBS 清洗(3 次)，蘇木素復染，鹽酸酒精分化后脫水10 min，封片后于鏡下觀察。隨機觀察5 個視野，以陽性比例與染色強度判定結果。

1.3 統計學方法 應用SPSS21.0 統計軟件分析數據。計量資料符合正態分布，以均數±標準差(x-±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗，采用多因素Logistic 回歸分析ICP 孕婦妊娠結局不良的危險因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ICP 組與對照組胎盤組織中ABCB4 mRNA與ABCB4 蛋白表達水平比較 ICP 組胎盤組織中ABCB4 mRNA 表達水平明顯低于對照組，ABCB4 蛋白陽性表達率明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1和圖1。

圖1 免疫組化法檢測ABCB4蛋白在胎盤組織中的表達(×400)

表1 ICP組與對照組胎盤組織中ABCB4 mRNA與ABCB4 蛋白表達水平比較

2.2 輕度與重度孕婦胎盤組織中ABCB4 mRNA與ABCB4 蛋白表達水平比較 重度組孕婦胎盤組織中ABCB4 mRNA 表達水平明顯低于輕度組，ABCB4蛋白陽性表達率明顯低于輕度組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 輕度與重度ICP孕婦胎盤組織中ABCB4 mRNA與ABCB4蛋白表達差水平比較

2.3 ICP 組與對照組孕婦的不良妊娠結局比較 ICP 組孕婦的羊水污染、胎兒窘迫、早產、新生兒窒息、圍生兒死亡發生率明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 ICP組與對照組孕婦的不良妊娠結局比較[例(%)]

2.4 影響ICP孕婦妊娠結局的因素 ICP組孕婦中共有46 例出現不良妊娠結局，發生率為46.94%。不同孕次、產次ICP孕婦不良妊娠結局發生率比較差異無統計學意義(P＞0.05)；年齡≥35歲、發病孕周≤34周、疾病程度為重度、ABCB4 蛋白陰性表達、ABCB4 mRNA低表達ICP孕婦不良妊娠結局發生風險高于年齡＜35 歲、發病孕周＞34 周、疾病程度為輕度、ABCB4蛋白陽性表達、ABCB4 mRNA 高表達ICP 孕婦,差異有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 影響ICP組妊娠結局的單因素分析[例(%)]

2.5 ICP 孕婦發生不良妊娠結局的獨立危險因素 將上述因素差異有統計學意義項納入多因素Logistic 回歸模型，以妊娠結局作為因變量，以上述差異有統計學意義項作為自變量，并進行賦值：年齡(＜35歲=0，≥35 歲=1)、發病孕周(＞34 周=0，≤34 周=1)、疾病程度(輕度=0，重度=1)、ABCB4 蛋白表達(陽性=0、陰性=1)、ABCB4 mRNA 表達(高表達=0，低表達=1)。經多因素Logisitic回歸分析結果顯示，高齡、發病孕周≤34 周、疾病程度高、ABCB4 蛋白陰性表達、ABCB4 mRNA低表達是ICP孕婦發生不良妊娠結局的獨立危險因素(P＜0.05)，見表5。

表5 ICP組孕婦不良妊娠結局多因素Logistic回歸分析

3 討論

臨床上ICP發病率為0.2%～20%，且疾病的發生具有明顯種族與地域差異，病因較為復雜，多數研究認為，ICP是多因素綜合作用下產生的結果，基因遺傳易感性決定了個體肝臟對雌激素代謝敏感性[6-7]。

近年來，隨著對遺傳和分子生物學研究的不斷深入，人們發現，肝臟存在膽淤相關基因，如ABCB4 基因、BSEP 基因、FIC1 基因等，均參與肝臟膽汁酸轉運與分泌載體等的編碼[8]。結構與功能方面，胎盤和肝臟具有一定的相似性，相關研究也表明絨毛和胎盤上均有膽淤相關基因的表達[9]。作為妊娠期特殊器官，胎盤在胎兒物質轉運中具有關鍵性作用，其中包括了膽汁酸的排泌，通常情況下，部分膽汁酸經胎兒腎臟排泄至羊水外，另外大部分膽汁酸則通過胎盤組織屏障轉運到母體血液循環中[10]。ABCB4 基因編碼的ABCB4 蛋白屬于P-糖蛋白超基因家族，主要于肝毛細膽管膜分布[11]。ELSEMIEKE 等[12]研究表明人體ABCB4基因突變可使DMR3蛋白缺乏，膽汁磷脂的分泌減少，導致膽管細胞凋亡或壞死，誘發膽汁淤積。

本研究中ICP 組孕婦ABCB4 mRNA 表達及ABCB4 蛋白陽性率低于對照組，且疾病嚴重程度高的患者相較于輕度患者ABCB4 mRNA 表達水平及ABCB4 蛋白陽性表達率更低，表明ICP 孕婦胎盤ABCB4基因表達水平相較于正常孕婦明顯降低，且其表達水平與疾病的嚴重程度相關，WEI 等[13]研究結果支持本研究結論。ABCB4 是肝臟毛細膽管膜磷脂輸出泵，可將磷脂轉運至毛細膽管并與毛細膽管內的膽鹽形成微膠粒，使膽管細胞免受膽鹽損傷，ABCB4 基因低表達可能導致膽管損傷，從而引起膽汁淤積[14]。相關研究表明ICP 對胎兒健康危害性極大，大大增加了不良妊娠結局風險[15]。本研究中ICP 組羊水污染、胎兒窘迫、早產、新生兒窒息、圍生兒死亡發生率均高于對照組，ICP孕婦高膽汁酸使得子宮肌收縮力增加，促進子宮收縮，導致早產發生；高膽汁酸具有毒性作用，可損傷細胞膜、線粒體膜等，生成氧自由基造成呼吸鏈功能的異常，造成胎兒急性缺氧；膽汁酸可促進胎兒結腸運動，促使胎便排出，導致羊水污染，增加不良妊娠結局風險。進一步分析ABCB4 基因表達水平與臨床ICP孕婦不良妊娠結局風險的關系，Logistic回歸分析結果顯示ABCB4 蛋白陰性表達、ABCB4 mRNA低表達是ICP孕婦不良妊娠結局的獨立危險因素。ABCB4 表達下降，DMR3蛋白功能、定位、降解異常，胎盤膽汁酸排泌速度受阻、效率下降，最終使ICP孕婦胎兒因血清膽汁酸明顯升高而加大不良妊娠結局風險。

綜上所述，ICP孕婦胎盤組織ABCB4基因呈現低表達狀態，胎盤組織ABCB4 基因表達水平與妊娠結局關系密切，ABCB4 基因表達水平下降可增加不良妊娠結局風險。