利多卡因通過miR-146b-5p調控胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的分子機制研究

呂艷玲，王冰

寶雞市人民醫院麻醉科，陜西 寶雞 721000

利多卡因是臨床常用的局部酰胺類麻醉劑，對急性或慢性疼痛疾病，如神經性疼痛、炎癥和傷害性疼痛具有突出的療效[1]。除此之外，利多卡因還具有顯著的抗癌活性[2]。研究表明，利多卡因可以抑制胃癌[3]、肺癌[4]、膀胱癌[5]和卵巢癌[6]等癌癥的生長和轉移。利多卡因是一種有效的腫瘤抑制劑，但其對胃癌作用機制的研究有限。微小RNA(microRNA，miRNA)不僅是管理細胞生長和發育的關鍵調節器，并且在調節藥物療效和毒性方面也發揮著重要作用[7]。研究證實miR-146b-5p在胃癌細胞中表達上調，被認為是胃癌的診斷和預后生物標志物[8]。較高水平的miR-146b-5p 能促進胃癌細胞增殖和減輕凋亡[9]。由于miR-146b-5p 在胃癌的發病機制中起重要作用，因此深入研究miR-146b-5p 在利多卡因功效中扮演的角色十分必要。本研究旨在探討利多卡因對胃癌細胞生物學行為的影響，以及其作用機制是否與miR-146b-5p 有關。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌細胞SNU-1(武漢普諾賽)，利多卡因(≥99.7%，100 mg；中國食品藥品檢定研究院)，anti-miR-NC、anti-miR-146b-5p、miR-NC、miR-146b-5p(上海Genepharma)，CCK-8 溶液(日本Dojindo)，BCA Protein Assay Kit(美國Pierce)，細胞周期蛋白D1(CyclinD1)兔單克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Cleaved Caspase-3)兔單克隆抗體、基質金屬蛋白酶2 (matrix metalloprotease，MMP2)兔單克隆抗體、MMP9 兔單克隆抗體(美國Abcam)，膜聯蛋白V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI) (上海Sangon)，逆轉錄試劑盒(上海Toyobo)，SYBR Green實時PCR試劑盒(德國Roche Diagnostics)。

1.2 細胞培養 SNU-1細胞在青霉素(100 IU/mL)、含鏈霉素(100 μg/mL)和10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養，培養箱保持濕潤、95%空氣、5%CO2的環境，溫度為37℃。

1.3 實驗分組 實驗共分為NC組、50 μmol/L利多卡因組、100 μmol/L利多卡因組、200 μmol/L利多卡因組、anti-miR-NC 組、anti-miR-146b-5p 組、miR-NC+200 μmol/L 利多卡因組和miR-146b-5p+200 μmol/L利多卡因組8 組。其中，NC 組SNU-1 細胞未經任何處理，50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L 利多卡因組SNU-1 細胞以50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L 利多卡因處理24 h[2]。anti-miR-NC組、anti-miR-146b-5p組、miR-NC+200 μmol/L利多卡因組和miR-146b-5p+200 μmol/L 利多卡因組SNU-1 細胞分別按照Lipofectamine 2000 試劑操作指南轉染anti-miR-NC、anti-miR-146b-5p、miR-NC、miR-146b-5p，轉染48 h后，收集細胞或以200 μmol/L利多卡因處理24 h。

1.4 CCK-8 法檢測細胞增殖 SNU-1 細胞重新接種到96孔板中(大約5×103個細胞/孔)。然后，將10 μL CCK-8 溶液加入到細胞中。細胞在由濕潤、95%空氣和5%CO2的環境中孵育1 h 后，通過酶標儀測定吸光度A值(450 nm)評估細胞增殖。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 SNU-1 細胞經不同處理后，接種到6孔板(大約1×105個細胞/孔)，用冷磷酸鹽緩沖液洗滌，然后重懸于結合緩沖液中，將細胞在5 μL Annexin V-FITC 和PI 中避光染色15 min。根據FACS can 流式細胞儀的說明進行流式細胞術檢測。凋亡結果通過FlowJo軟件計算。

1.6 Transwell 檢測細胞遷移及侵襲 細胞遷移測定通過Transwell 小室進行。上層填充有稀釋于無血清培養基的SNU-1 細胞。下層補充有血清培養基。37℃孵育后，用甲醇固定細胞，將SNU-1 細胞用0.5%結晶紫染色10 min，計算遷移到膜下側的細胞數。細胞侵襲測定與細胞遷移測定類似，但在細胞侵襲測定中，Transwell小室上層預先涂有基質膠。其余步驟與細胞遷移測定相同。

1.7 Western blot 檢 測CyclinD1、Cleaved Caspase-3、MMP2、MMP9 蛋白相對表達 通過使用蛋白提取試劑盒獲得SNU-1 細胞中的蛋白質，采用BCA Protein Assay Kit計算蛋白濃度。等量的蛋白質(30 μg)在100℃下于上樣緩沖液中變性15 min。將含有等量蛋白并在樣品緩沖液中制備的樣品加載到8%～12%SDS/PAGE 孔中，并通過電壓梯度轉移到PVDF 膜上。將膜在5%脫脂牛奶中封閉過夜，與抗CyclinD1、抗Cleaved Caspase-3、抗MMP2、抗MMP9、抗β-actin(內源性對照)一抗在4℃下輕搖過夜，與羊抗兔二抗孵育。顯影后通過Image Lab軟件估計不同的蛋白條帶。

1.8 實時定量PCR 檢測miR-146b-5p 表達 用TRIzol 試劑從不同處理SNU-1 細胞中提取總RNA。使用逆轉錄試劑盒和miRNA 特異性miRNA RT 引物從RNA樣品中產生cDNA。U6 snRNA用作數據標準化的內源性對照。使用SYBR Green實時PCR試劑盒在ABI Prism 7500序列檢測系統上進行實時PCR。使用2-ΔΔCt方法確定相對miR-146b-5p 表達。引物序列(5′-3′)為miR-146b-5p F：GGGCGGTGAGAACTGAATT，miR-146b-5p R：CAGTGCGTGTCGTGGAGT；U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACA，U6 R：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.9 統計學方法 應用SPSS22.0 軟件進行數據統計分析。計量數據以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組數據間比較采用獨立樣本t檢驗，組間多重比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度利多卡因對SNU-1 細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 不同濃度利多卡因處理SNU-1細胞后，與NC組比較，50 μmol/L利多卡因組、100 μmol/L利多卡因組、200 μmol/L利多卡因組細胞的增殖能力逐漸減弱，凋亡率逐漸增加，遷移和侵襲數量逐漸減少，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1和圖1。

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡

表1 不同濃度利多卡因對SNU-1細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響(±s，n=9)

表1 不同濃度利多卡因對SNU-1細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響(±s，n=9)

注：與NC比較，aP＜0.05。

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2.2 不同濃度利多卡因對SNU-1 細胞中有關蛋白表達的影響 不同濃度利多卡因處理SNU-1細胞后，與NC 組比較，50 μmol/L 利多卡因組、100 μmol/L利多卡因組、200 μmol/L 利多卡因組細胞的CyclinD1蛋白、MMP2 蛋白和MMP9 蛋白的表達量逐漸降低，Cleaved Caspase-3 蛋白表達量逐漸增加，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2和圖2。

圖2 Western blot檢測CyclinD1、Cleaved Caspase-3、MMP2、MMP9蛋白相對表達

表2 不同濃度利多卡因對SNU-1細胞中有關蛋白表達的影響(±s，n=9)

表2 不同濃度利多卡因對SNU-1細胞中有關蛋白表達的影響(±s，n=9)

注：與NC比較，aP＜0.05。

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2.3 不同濃度利多卡因對miR-146b-5p表達的影響 50 μmol/L 利多卡因組、100 μmol/L 利多卡因組、200 μmol/L 利多卡因組SNU-1 細胞的miR-146b-5p表達量分別為0.86±0.08、0.61±0.07、0.47±0.04，均少于NC 組的1.00±0.09，差異均有統計學意義(F=98.114，P＜0.05)。

2.4 anti-miR-146b-5p 對SNU-1 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 轉染anti-miR-146b-5p后，anti-miR-146b-5p 組SNU-1 細胞的miR-146b-5p和CyclinD1 蛋白的表達量比anti-miR-NC 組低，Cleaved Caspase-3 蛋白表達量比anti-miR-NC 組高，MMP2、MMP9 蛋白的表達量、增殖能力比anti-miR-NC 組低，凋亡率比anti-miR-NC 組高，且遷移和侵襲數量比anti-miR-NC 組低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3和圖3。

圖3 anti-miR-146b-5p上調對SNU-1細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

表3 anti-miR-146b-5p對SNU-1細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響(±s，n=9)

表3 anti-miR-146b-5p對SNU-1細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響(±s，n=9)

注：與anti-miR-NC比較，aP＜0.05。

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2.5 miR-146b-5p 可以逆轉利多卡因對SNU-1細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 miR-146b-5p+200 μmol/L 利多卡因組SNU-1 細胞的miR-146b-5p、CyclinD1 蛋白的表達量高于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因組，Cleaved Caspase-3 蛋白表達量低于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因組，MMP2、MMP9蛋白表達量、增殖能力高于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因組，凋亡率低于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因組，遷移和侵襲數量高于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表4和圖4。

圖4 miR-146b-5p可以逆轉利多卡因對SNU-1細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

表4 miR-146b-5p可以逆轉利多卡因對SNU-1細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響(±s，n=9)

表4 miR-146b-5p可以逆轉利多卡因對SNU-1細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響(±s，n=9)

注：1組，miR-NC+200 μmol/L利多卡因；2組，miR-146b-5p+200 μmol/L利多卡因；與1組比較，aP＜0.05。

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3 討論

麻醉劑也可能影響癌癥的進展。利多卡因是一種常用的局部麻醉劑，其抗癌作用被廣泛報道。諸多研究揭示利多卡因不僅抑制癌細胞生長、加速細胞凋亡，還抑制細胞遷移和侵襲[10-11]。資料顯示，利多卡因通過調節miR-145 表達抑制胃癌MKN45 細胞的活力、增殖、遷移和侵襲，同時增強細胞凋亡[12]。利多卡因通過調節胃癌細胞中的環狀RNA ANO5/miR-21-5p/LIFR軸導致細胞增殖、遷移、侵襲減少，以及細胞凋亡增加[13]。在肝癌中，利多卡因通過靶向肝癌細胞中的環狀RNA DYNC1H1/miR-520a-3p/USP14 軸來阻止腫瘤進展[14]。本研究探討了利多卡因對胃癌SNU-1 細胞生長、遷移和侵襲的抑制作用。根據本研究的數據，50 μmol/L、100 μmol/L 和200 μmol/L 利多卡因顯著抑制SNU-1 細胞的增殖、遷移和侵襲，但促進細胞凋亡，這些發現與先前的研究一致。Cleaved Caspase-3 被認為是調節細胞凋亡的因子[15]。MMP2、MMP9 是遷移和侵襲的關鍵調節因子。本研究還發現利多卡因下調CyclinD1、MMP2 和MMP9 水平，同時促進Cleaved Caspase-3 表達，與SUI 等[12]報道的利多卡因下調胃癌MKN45 細胞中CyclinD1、MMP2、MMP9 表達及上調Cleaved Caspase-3 表達一致。總之，本研究的數據與之前的結果一致，這為利多卡因抗胃癌作用提供了新的證據。

作為細胞生長發育的重要調節因子，miRNA參與控制包括胃癌在內的多種癌細胞的增殖、凋亡和侵襲行為。miR-146b-5p是一種具有致癌[16]和腫瘤抑制活性[17]的癌癥相關miRNA。最近，有人提出miR-146b-5p在胃癌中的表達增加[18-19]，誘導miR-146b-5p 的下調有助于治療胃癌[9]或抑制結腸癌的生長和轉移[20]。此外，miR-146b-5p 表達與晚期甲狀腺乳頭癌相關，miR-146b-5p 在體外促進甲狀腺乳頭癌細胞的增殖、遷移、侵襲和細胞周期[21]。可見miR-146b-5p是胃癌、甲狀腺乳頭癌等的腫瘤促進劑。本研究的結果表明，沉默miR-146b-5p使SNU-1細胞的增殖能力、遷移和侵襲能力減弱，而凋亡水平增加，與前人研究[9，20]吻合。利多卡因使SNU-1 細胞中的miR-146b-5p 表達減少，猜測利多卡因可以通過降低miR-146b-5p水平來阻滯胃癌的發生發展。此前，一些miRNA被報道參與利多卡因的抗癌功能，如利多卡因抑制肺癌A549 和NCI-H1299細胞的增殖和轉移，同時誘導細胞凋亡，機制與上調miR-539有關[22]。利多卡因通過下調miR-10b減輕順鉑耐藥，并抑制胃癌順鉑耐藥細胞的遷移和侵襲[23]。進一步的結果表明，miR-146b-5p 高表達逆轉了利多卡因誘導的SNU-1 細胞增殖、遷移、侵襲的降低和細胞凋亡的增加。此外，miR-146b-5p 高表達逆轉了利多卡因誘導的增殖、轉移和凋亡相關蛋白的變化。因此，利多卡因對胃癌細胞具有抗生長和抗轉移作用，其抗腫瘤特性可能是通過下調miR-146b-5p 實現的。

總之，本研究闡明了利多卡因在胃癌中發揮抗生長和抗轉移作用的機制，利多卡因通過下調miR-146b-5p來抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并加速凋亡，為利多卡因在胃癌中的作用機制提供了新的見解。