利多卡因抑制糖尿病小鼠Kupffer細胞炎癥反應(yīng)及對肝膿腫形成的影響

王睿斌， 盧雨征， 朱靜林， 王 為， 賈 光

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀壇醫(yī)院 急診科， 北京 100038

糖尿病是一種以高血糖為表現(xiàn)的慢性代謝性疾病。據(jù)2015年國際糖尿病聯(lián)合會統(tǒng)計，全球有4.15億人被診斷出患有糖尿病，500萬人死于糖尿病，中國糖尿病患者占全球病例的25%[1]。糖尿病已成為中國公共衛(wèi)生和經(jīng)濟社會發(fā)展的嚴重負擔。糖尿病患者易發(fā)多種并發(fā)癥，其是并發(fā)細菌性肝膿腫的最大危險因素[2]。糖尿病患者由于對感染的遺傳易感性，且長時間的高血糖改變了細胞和體液免疫防御機制，以及局部血液供應(yīng)不足和神經(jīng)損傷，還有與糖尿病相關(guān)的代謝改變，從而易發(fā)生感染[3]。肝膿腫在糖尿病患者中發(fā)病率較高，且致病菌主要為肺炎克雷伯桿菌[4]。肝Kupffer細胞是位于肝竇中的巨噬細胞，其作用是參與清除侵入肝臟的細菌[5]。Kupffer細胞在對抗胃腸道來源的細菌感染方面發(fā)揮了重要作用。糖尿病患者Kupffer細胞被激活[6]，會釋放大量炎癥介質(zhì)[7]，如： TNFα、IFNγ、IL和NO等[5,8]。高血糖還會造成巨噬細胞缺氧應(yīng)激并損傷其功能[9-11]。因此，肝Kupffer細胞功能障礙可能是糖尿病患者易發(fā)肝膿腫的原因之一。利多卡因不僅是常用的局部麻醉藥物，其還可以通過作用于NF-κB信號通路，抑制炎癥介質(zhì)釋放而達到抗炎作用[12]。但利多卡因是否能改善糖尿病患者的Kupffer細胞功能尚未見報道。為探討利多卡因?qū)μ悄虿「蜬upffer細胞的保護作用及是否會影響肝膿腫的形成，本研究應(yīng)用利多卡因作用于克雷伯桿菌感染的糖尿病小鼠并體外培養(yǎng)其肝Kupffer細胞，觀察利多卡因?qū)ζ溲装Y反應(yīng)的抑制作用及對其吞噬功能的改善情況以及其對肝膿腫形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 SPF級C57BLKS/J db/db小鼠，C57BLKS/J db/m小鼠各10只，8周齡，雌性，體質(zhì)量26～28 g，購于常州卡文斯實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2018-0010，動物使用許可證號：SYSK(京)2017-0025。克雷伯桿菌菌株購自上海素冉生物科技有限公司(貨號：ATCC13883)，利多卡因購自北京紫竹藥業(yè)有限公司(批號:20170841)。胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，1640培養(yǎng)基，細胞間黏附分子1(ICAM-1)單克隆抗體，IL-6，TNFα，IFNγ檢測試劑盒購自北京科碩生物技術(shù)有限公司(批號:A2040101，20650422，71671025， MA4506， BMS513HS，BMS706-2，PMC5025)。PVDF膜購自中科天銳(北京)科技有限公司(批號:H33072)。聚苯乙烯乳珠購自北京歐北生物科技有限公司(批號:8002-42-5)。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 菌株復(fù)蘇后接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，150 r/min振蕩培養(yǎng)3～5 h，取100 μL菌液鋪于LB固體培養(yǎng)板，倒置于37 ℃孵箱，培養(yǎng)16 h后收集活菌于PBS，紫外分光光度計測定650 nm OD值確定細菌濃度。

1.2.2 試驗動物分組及給藥 將C57BLKS/J db/db小鼠分為糖尿病對照組和糖尿病+利多卡因組，將C57BLKS/J db/m小鼠分為非糖尿病對照組和非糖尿病+利多卡因組，每組5只。小鼠連續(xù)7 d口服20 μL含1×107CFU 高黏性肺炎克雷伯桿菌的懸液，利多卡因干預(yù)組給予利多卡因經(jīng)鼠尾靜脈注射(1 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)1周。1周后處死所有小鼠后迅速無菌取出股骨和脛骨及肝臟，肝臟組織病理切片檢查有無肝膿腫。

1.2.3 小鼠肝Kupffer細胞及中性粒細胞分離培養(yǎng) 肝臟組織切碎，約1 mm3大小，加入0.1%Ⅳ型膠原蛋白酶37 ℃消化40 min，消化液過濾并離心后用完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+1%PBS)重懸。沿離心管壁分別加入3 mL 70%、30%細胞分離液和2 mL上述離心重懸液，400 r/min離心20 min，吸管吸出上層薄層，完全培養(yǎng)基重懸，300 r/min離心5 min，共2次，鋪瓶，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。4 h后除去上清，PBS清洗1遍，去除未貼壁的細胞，貼壁細胞為Kupffer細胞。

取股骨和脛骨剪去兩端軟骨，露出紅色的骨髓腔。1 mL無菌注射器，吸取少量含有10%標準胎牛血清的稀釋液，沖洗骨髓腔以獲取骨髓。制備成2×108～1×109/mL 的單細胞懸液備用。離心管中加入分離液并將細胞懸液平鋪到分離液液面上方，離心后出現(xiàn)明顯的分層：分離液中為粒細胞層。取細胞用完全培養(yǎng)基(1640+10%FBS+1%PBS)重懸，鋪瓶。

1.2.4 透射電鏡檢測Kupffer細胞細胞器改變 小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)移至含有2.5%戊二醛溶液的EP管中，固定1 h，后轉(zhuǎn)移至1 mol/L磷酸鹽緩沖液，并洗滌3次，每次5 min。1%鋨酸固定30 min，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌2次，每次5 min。3%～4%瓊脂預(yù)包埋固化后，切成約1 mm3的小塊。加入50%、70%、90%乙醇溶液和90%丙酮、10%丙酮脫水。環(huán)氧樹脂浸漬、包埋、聚合、超片，在FEI Tecnai G212透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.5 Griess法檢測NO水平 等量細胞培養(yǎng)基與Griess試劑在室溫下混合反應(yīng)20～25 min。546～550 nm波長處讀取NO的OD值，計算濃度。

1.2.6 ELISA法定量測定Kupffer細胞的IL-6、TNFα、IFNγ水平 純化抗體包被微孔板制成固相抗體，微孔中加入標準品或樣品及IL-6、TNFα、IFNγ抗體、HRP標記親和素，徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-6、TNFα、IFNγ呈正相關(guān)。酶標儀在(450±2)nm波長下測定OD值，計算樣品濃度。

1.2.7 Western Blot法檢測Kupffer細胞 ICAM-1表達水平 Kupffer細胞經(jīng)RIPA裂解緩沖液進行細胞裂解。提取蛋白質(zhì)通過二辛可寧酸定量分析。樣品加到SDS-PAGE凝膠加樣孔內(nèi)，后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，37 ℃下與一抗溫育過夜。 TBS-T洗滌3次，每次10 min，將膜與HRP綴合的二抗在室溫下孵育1.5 h。將膜置于免疫印跡儀內(nèi)，拍照并記錄結(jié)果。電泳帶灰度值掃描，并對目的蛋白半定量分析。以目的條帶與內(nèi)參條帶的吸光度比值表示目的蛋白的相對水平。

1.2.8 transwell小室檢測中性粒細胞的趨化功能 24孔8.0 μm孔徑PC膜transwell小室，每份中性粒細胞懸液加入2個小室。下室加入500 μL細胞密度為2×105/mL各組Kupffer細胞懸液，細胞匯合度達80%后棄去上清，加入500 μL完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+1%PBS)，上室加入200 μL中性粒細胞懸液(密度為2×105/mL)，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)2 h，棄去上室液體，PBS洗滌2遍，棉簽擦去上室膜的未趨化細胞，移去小室，倒置并風干。下室加入0.1%結(jié)晶紫染液500 μL， 37 ℃孵育30 min，棄去染液，PBS洗滌2遍，隨機取5個視野，進行中性粒細胞計數(shù)。

1.2.9 Kupffer細胞的吞噬功能測定 取接種于蓋玻片的Kupffer細胞，每皿加入聚苯乙烯乳珠 1×108個，培養(yǎng)60 min，蓋玻片PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，Giemsa染色后倒置顯微鏡下觀Kupffer細胞吞噬聚苯乙烯乳珠情況并計數(shù)。每片隨機取5個視野，每個視野隨機取10個Kupffer細胞進行計數(shù)，取每皿Kupffer細胞吞噬聚苯乙烯乳珠數(shù)的平均值。

2 結(jié)果

2.1 Kupffer細胞超微結(jié)構(gòu)觀察 糖尿病小鼠(圖1a)與非糖尿病小鼠(圖1b)比較，Kupffer細胞中細胞核呈橢圓形或腎形，并偶可見核膜斷裂，線粒體與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量減少，并可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體腫脹及脂滴增多，溶酶體稍有減少。

注：a，糖尿病小鼠；b，非糖尿病小鼠。紅色箭頭為線粒體；綠色箭頭為

2.2 各組小鼠Kupffer細胞NO、TNFα、IL-6、IFNγ及ICAM-1表達水平 糖尿病對照組與非糖尿病對照組相比NO、TNFα、IL-6、IFNγ水平均升高(P值均<0.05)(表1)，ICAM-1表達水平亦升高(P<0.05)(表1，圖2)。與糖尿病對照組比較，糖尿病+利多卡因組NO、TNFα、IL-6、IFNγ水平均降低(P值均<0.05)(表1)，ICAM-1表達水平亦減低(P<0.05)(表1，圖2)。非糖尿病對照組與非糖尿病+利多卡因組比較各項指標均未見明顯變化(P值均>0.05)(表1，圖2)。

表1 各組小鼠Kupffer細胞 NO、IL-6、TNFα、IFNγ、ICAM-1水平

圖2 Western Blot檢測各組小鼠Kupffer細胞 ICAM-1表達

2.3 各組小鼠中性粒細胞趨化和Kupffer細胞吞噬功能

糖尿病對照組與非糖尿病對照組相比，中性粒細胞趨化增強(P<0.05)(表2，圖3a、b)，糖尿病+利多卡因組與糖尿病對照組相比，中性粒細胞趨化減弱(P<0.05)(表2，圖3b、d)，非糖尿病對照組與非糖尿病+利多卡因組相比，中性粒細胞趨化無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2，圖3a、c)。糖尿病組與非糖尿病對照組相比，Kupffer細胞吞噬能力減弱(P<0.05)(表2，圖4a、b)，糖尿病+利多卡因組與糖尿病對照組相比，Kupffer細胞吞噬能力增強(P<0.05)(表2，圖 4b、d)，非糖尿病對照組與非糖尿病+利多卡因組相比，Kupffer細胞吞噬能力無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2，圖4a、c)。

表2 各組小鼠中性粒細胞招募、吞噬功能水平

注：a，非糖尿病對照組;b，糖尿病對照組;c，非糖尿病+利多卡因組;

2.4 各組小鼠肝膿腫形成 糖尿病對照組小鼠形成2例(40%)肝膿腫,余各組均無肝膿腫形成(圖5)，各組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：a，非糖尿病對照組; b，糖尿病對照組; c，非糖尿病+利多卡因組;d，糖尿病+利多卡因組。

注：a，肝膿腫形成；b，正常肝臟。

3 討論

2019年全球約4.63億20～79歲成人罹患糖尿病，預(yù)計到2030年，糖尿病患者將達到5.784億；中國是糖尿病患者數(shù)量最多的國家[13]。糖尿病患者由于多有免疫功能障礙，神經(jīng)病變和血液循環(huán)不良，因此容易促進細菌生長導(dǎo)致感染的發(fā)生[14-15]。與正常人相比，糖尿病患者發(fā)生化膿性肝膿腫的風險增加35.3%[16]。糖尿病相關(guān)肝膿腫的致病菌主要為肺炎克雷伯桿菌，這可能與糖尿病患者血管內(nèi)膜異常，易使獲得性肺炎克雷伯桿菌發(fā)生血源性播散有關(guān)[17-18]。Kupffer細胞是肝血竇內(nèi)的巨噬細胞，是病原體進入肝臟的第一道防線，參與清除入侵肝竇的細菌和病毒[5,15,19]。本研究通過透射電鏡觀察了糖尿病小鼠Kupffer細胞的線粒體、溶酶體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，發(fā)現(xiàn)它們的數(shù)量明顯低于非糖尿病小鼠且質(zhì)量不佳。因炎癥反應(yīng)與應(yīng)激信號可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)影響細胞代謝，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改變在2型糖尿病的發(fā)展過程中也起到了一定的作用[20]。線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量減少可能意味著Kupffer細胞的功能減弱[21]。因此患有糖尿病的小鼠，其Kupffer細胞的功能受到了顯著影響。同時由于糖尿病小鼠的Kupffer細胞功能紊亂，吞噬能力明顯低于非糖尿病小鼠。此前的研究也證實高血糖可通過缺氧應(yīng)激導(dǎo)致巨噬細胞功能受到抑制[9-11]。

糖尿病患者微環(huán)境通常處于異常的全身慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài)[22-24]，其體內(nèi)Kupffer細胞被內(nèi)毒素、TNF等激活，并大量釋放TNFα、TGF、IFN、IL、氧自由基、NO等炎癥介質(zhì)[5,8]。靜息狀態(tài)下Kupffer細胞表面ICAM-1呈低表達，但可通過炎癥介質(zhì)上調(diào)其表達[25]。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠中Kupffer細胞表面的ICAM-1呈高表達，因此證實糖尿病小鼠的Kupffer細胞處于激活狀態(tài)。糖尿病組與非糖尿病組小鼠相比其Kupffer細胞中NO、IL-6、IFNγ和TNFα的分泌增加，ICAM-1的表達增強。因此，糖尿病小鼠的Kupffer細胞處于激活狀態(tài)，與糖尿病是一種由于營養(yǎng)代謝異常導(dǎo)致的全身性慢性炎癥性疾病的認知相符[22,24]，而轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在糖尿病和慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[26-27]。

利多卡因被廣泛用作局麻藥和抗心律失常藥。有研究表明利多卡因?qū)ρ芟到y(tǒng)有保護作用[28-29]，并可抑制炎癥因子的表達[12]，還具有抗腫瘤作用。通常認為局麻藥具有良好的抗炎作用，其可減弱炎性Src信號并抑制PI3K-Akt-NO通路，從而可阻斷Src依賴的中性粒細胞粘附和內(nèi)皮細胞高通透性[28]。利多卡因可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，抑制細胞炎癥反應(yīng)[9]，還可通過抑制炎癥介質(zhì)來保護內(nèi)皮細胞功能[28]。本研究發(fā)現(xiàn)利多卡因可抑制糖尿病小鼠炎癥介質(zhì)的釋放，下調(diào)了其Kupffer細胞表面ICAM-1的表達，并減少了粒細胞招募，同時也改善了糖尿病小鼠Kupffer細胞的吞噬能力。由此認為利多卡因可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路改善糖尿病小鼠的全身性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，使糖尿病小鼠Kupffer細胞由激活狀態(tài)調(diào)整為靜息狀態(tài)，并使其吞噬能力得到改善；提示利多卡因?qū)μ悄虿⌒∈驥upffer細胞起到了一定程度的保護作用。但在本研究中利多卡因并未顯示可減少糖尿病小鼠肝膿腫形成的風險。

本研究的主要局限性包括樣本量相對較小和對假設(shè)的分子機制缺乏功能驗證。ICAM-1表達只檢測到了翻譯水平，而不是轉(zhuǎn)錄水平。而小鼠細菌性肝膿腫模型的建立因樣本量較少也缺乏代表性。

綜上所述，糖尿病小鼠的Kupffer細胞激活招募粒細胞，顯著地釋放炎癥介質(zhì)且有吞噬功能的障礙，而利多卡因具有恢復(fù)吞噬功能和抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用，但對細菌性肝膿腫的形成并沒有明顯的改善作用。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2016年10月經(jīng)由北京世紀壇醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批，批號：sjtkyll-lx-2016(103)，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：王睿斌負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；盧雨征、朱靜林參與整理數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)分析；王為、賈光參與實驗操作及論文撰寫。