非酒精性脂肪性肝病患者糞便短鏈脂肪酸含量測定的臨床意義

李 惠， 王學紅， 馬臻棋， 馬文霞， 楊麗萍

1 青海大學， 西寧 810016； 2 青海大學附屬醫院 消化內科， 西寧 810001

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代謝綜合征的肝表現，常合并肥胖、血脂異常及胰島素抵抗(IR)，疾病譜包括單純性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌。NAFLD也是西方國家常見的慢性肝病，預計到2030年NAFLD將成為肝移植最常見的適應證[1-3]。NAFLD可導致肝病殘疾和死亡，還與代謝綜合征 (metabolic syndrome,MetS)、2型糖尿病(T2DM)、動脈硬化性心血管疾病及結直腸腫瘤等密切相關[2]。研究[4]顯示從1997年—2014年，NAFLD發病率增加了5倍，其中18～39歲的年輕人增長率最高(7倍)，表明NAFLD發病率顯著增加且逐漸年輕化。當前認為NAFLD是與遺傳-環境-代謝應激相關且無過量飲酒史、肝細胞脂肪變性和脂質貯積為特征的臨床病理綜合征[5]。至今NAFLD的發病機制仍未完全闡明，經典的“雙重打擊學說”[6]認為肥胖和IR會造成脂質在肝細胞中堆積，為肝細胞承受的“第一次打擊”，繼之出現氧化應激、線粒體功能障礙、脂質過氧化等進一步促進肝細胞炎癥反應；目前廣為認可的“多重打擊學說”[7]是在“雙重打擊學說”的基礎上，先天免疫調節紊亂、自噬、營養元素、腸-肝軸、表觀遺傳學也是影響NAFLD向NASH發展的重要因素。研究[8]證明腸道菌群-代謝物，腸-肝軸之間存在一定程度聯系，并且參與NAFLD的發生發展。作為腸-肝軸重要組成部分，腸道菌群通過增加宿主能量攝入、調節膽堿及膽汁酸代謝、激活模式識別受體等機制促發炎癥反應，促使NAFLD發生發展；短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA)是腸道菌群分解碳水化合物或氨基酸的代謝物，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、異丁酸、異戊酸、異己酸等，其中乙酸、丙酸、丁酸的含量較高。正常菌群每日可產生50～100 mmol/L的SCFA，為腸道上皮細胞提供能量，其可通過降低結腸pH、抑制病原體生長、促進水鈉吸收等途徑參與腸道免疫穩態的調控[9]。多項研究[10-11]表明，SCFA影響NAFLD的進展，具體機制尚不清楚。越來越多證據[12-14]表明，SCFA在維持腸道和代謝方面發揮重要作用。本研究初步探討SCFA腸道代謝與NAFLD發病機制的關系，為NAFLD的后續防治及臨床診斷提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 通過前瞻性研究方法，選取2020年7月—2021年7月在青海大學附屬醫院臨床診斷為NAFLD的患者共90例，其中NAFL組30例(有病理組織學診斷患者10例)、NASH組30例(有病理組織學診斷患者22例)、非酒精性脂肪性肝纖維化30例(有病理組織學診斷患者30例)，90例患者均行Fibroscan檢測。分組依據參照《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[15]中臨床分型標準，并選取同期健康體檢者40例作為對照組。同時選取NASH組高危患者16例(合并高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠心病、肺氣腫、肺心病等)進行隨訪，脫失病例6例，最終納入NASH高危患者10例。

納入標準：(1)居住青海地區10年以上；(2)年齡18～65歲；(3)無飲酒史或過去12個月每周飲用乙醇量男性<210 g，女性<140 g；(4)合并并發癥者(高血糖、高血脂、高血壓、高尿酸等)；(5)肝臟影像學表現符合彌漫性脂肪肝的影像學診斷標準；(6)肝活組織檢查組織學改變符合脂肪性肝病的病理學診斷標準。以上符合1～4項和第5或第6中任何一項。排除標準：(1)既往有慢性病毒肝炎感染、有嚴重的自身免疫性疾病、肝豆狀核變性、全胃腸外營養、長期不規律口服藥物(抗生素、中藥、藏藥等)者；(2)既往有大量飲酒史者(過去12個月每周飲用乙醇量男性≥210 g，女性≥140 g)；(3)臨床病理資料不完整者。

1.2 資料采集 所有研究對象采集病史，編號后記錄姓名、年齡、飲酒情況，計算BMI，進一步采集糞便標本，標本編號后置于-80 ℃冰箱保存。Fibroscan檢查所有研究對象受控衰減參數(CAP)和肝臟硬度值(LSM)。全自動生化分析儀檢測各組標本的ALT、AST、GGT、糖化血紅蛋白(HbA1c)、空腹血糖(FPG)、TG、TC、尿酸(UA)、TBil、DBil、IBil、Alb、Glb、ALP、膽汁酸(TBA)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)。全自動生化分析儀檢測健康組及非酒精性脂肪性肝纖維化組三型前膠原肽(PⅢP N-P)、四型膠原(Ⅳ-C)、透明質酸(HA)、層粘連蛋白(LN)，與SCFA聯合分析對非酒精性脂肪性肝纖維化診斷價值。

1.3 SCFA水平檢測 (1)GC-MS 檢測方法。色譜條件：色譜柱 Agilent HP-INNOWAX 毛細管柱(30 m×0.25 mm ID×0.25 μm)；分流進樣，進樣量1 μL，分流比10∶1。進樣口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃。程序升溫起始溫度90 ℃；然后以10 ℃/min升溫至120 ℃；再以5 ℃/min升溫至150 ℃；最后以25 ℃/min 升溫至250 ℃維持 2 min。載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL/min。MS 條件：電子轟擊電離(EI)源， SIM 掃描方式，電子能量 70 eV。(2)主要試劑。磷酸(國藥)，乙醚(國藥)，乙酸(sigma≥ 99.5%)，丙酸(sigma>99.0%)，丁酸(sigma>99.0%)，異丁酸(sigma>99.0%)，戊酸(sigma>98.0%)，異戊酸(sigma>99.0%)，己酸(阿拉丁≥99.5%)，異己酸(sigma>98%)。(3)主要儀器平臺。Thermo TRACE 1310-ISQ LT 氣-質聯用儀(Thermo，美國)；渦旋儀(QL-866)；冷凍離心機(湘儀，H1850R)。(4)標準品配置。量取乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸純標準品適量，用乙醚配制成0.02、0.1、0.5、2、5、10、50、100、250、500 μg/mL 10個混合標準濃度梯度。母液及工作標準溶液均保存于 0 ℃。(5)樣品前處理。取適量樣本，加50 μL 15%磷酸，再加125 μg/mL的內標(異己酸)溶液100 μL和乙醚400 μL勻漿1 min，于4 ℃ 12 000 r/min心10 min，取上清上機測試。

2 結果

2.1 一般資料 入選的90例患者中男56例，女34例，平均年齡(49.82±10.95)歲；健康對照組40例，其中男23例，女17例，平均年齡(49.10±10.85)歲。各組性別、年齡一般基線資料差異無統計學意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 4組研究對象人口學資料比較

2.2 生化指標比較 NAFL組、NASH組、非酒精性脂肪性肝纖維化組BMI、FPG、TG、DBil、CAP均明顯高于健康對照組，IBil、Alb、APTT均明顯低于健康對照組(P值均<0.05)；非酒精性脂肪性肝纖維化組BMI、HbA1c、ALT、AST、GGT、TBA、LSM明顯高于NAFL組(P值均<0.05)；非酒精性脂肪性肝纖維化組BMI、TBil、DBil、IBil均低于NASH組(P值均<0.05)，Alb、LSM均高于NASH組(P值均<0.05)；NASH組BMI、HbA1c、ALT、AST、GGT、LSM均高于NAFL組(P值均<0.05)(表2)。

表2 4組研究對象臨床生化指標比較

2.3 各組SCFA水平測定 非酒精性脂肪性肝纖維化組戊酸、己酸含量顯著高于健康對照組，NAFL組戊酸、己酸含量顯著低于健康對照組(P值均<0.05)；非酒精性脂肪性肝纖維化組戊酸、己酸含量顯著高于NAFL組(P值均<0.05)；非酒精性脂肪性肝纖維化組戊酸含量顯著高于NASH組(P<0.05)；NASH組己酸含量顯著高于NAFL組(P<0.05)(表3)。

表3 4組研究對象SCFA水平測定

2.4 疾病嚴重程度與SCFA的相關性 相關分析顯示疾病嚴重程度與丁酸、戊酸、己酸顯著正相關(r值分別為0.238、0.531、0.510，P值分別為0.024、<0.001、<0.001)，與乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸無相關性(P值均>0.05)。

2.5 NASH組高危患者治療前后對比分析

2.5.1 臨床指標比較 NASH組高危患者10例治療后HbA1c、FPG、TG、TC、ALT、AST、GGT、TBA、PT、UA、CAP、LSM均明顯低于治療前(P值均<0.05)(表4)。

表4 治療前后臨床指標比較

2.5.2 治療前后SCFA指標比較 NASH組高危患者10例治療后乙酸、丙酸含量均高于治療前(P值均<0.05)；異丁酸含量低于治療前(P<0.05)(表5)。

表5 治療前后SCFA水平比較

2.6 SCFA診斷非酒精性脂肪性肝纖維化患者ROC曲線下面積(AUC) 由圖1得出戊酸診斷非酒精性脂肪性肝纖維化的AUC為0.842(95%CI：0.747～0.938)，最佳界值為141.42 μg/g，靈敏度86.7%，特異度70%；己酸診斷非酒精性脂肪性肝纖維化的AUC為0.819(95%CI：0.718～0.920)，最佳界值為6.93 μg/g，靈敏度70%，特異度85%；PⅢP N-P診斷非酒精性脂肪性肝纖維化的AUC為0.881(95%CI：0.802～0.960)，最佳界值為68.06 ng/mL，靈敏度73.3%，特異度90%；Ⅳ-C診斷非酒精性脂肪性肝纖維化的AUC為0.803(95%CI：0.699～0.907)，最佳界值為60.12 ng/mL，靈敏度80%，特異度75%；HA診斷非酒精性脂肪性肝纖維化的AUC為0.703(95%CI：0.572～0.834)，最佳界值為104.46 ng/mL，靈敏度80%，特異度67.5%。

2.7 腸道內主要微生物數量及其代謝產物 腸道內主要菌屬為擬桿菌屬、真桿菌屬、雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬、消化鏈球菌屬等8種，大部分菌屬主要發酵產物為乙酸、丁酸(表6)。

圖1 SCFA及PⅢP N-P、Ⅳ-C、HA、LN診斷非酒精性脂肪性肝纖維化ROC曲線

表6 腸道內主要微生物數量及其代謝產物

3 討論

NAFLD的發病機制與遺傳、環境、生活方式、高脂飲食(HFD)、肥胖、血脂代謝紊亂、糖尿病及MetS等多種因素有關[16]。NAFLD也是肝細胞癌的主要危險因素之一，預計將成為全球最常見的慢性肝病[17]。目前在治療NAFLD的全球流行及其相關代謝和肝臟并發癥方面存在巨大挑戰，NAFLD的早期診斷及干預治療至關重要，目前的治療方法有節制飲食、調整飲食結構并增加運動的生活方式、減重和代謝治療(內鏡和外科手術)、藥物治療、相關并發癥的治療，效果并不顯著，并且多數NAFLD患者早期無癥狀，在進展為肝硬化之前，疾病可能保持沉默。NAFLD患者在初次就診時發現的最常見癥狀為肝區輕微疼痛和疲勞，或根據偶然的影像學檢查發現脂肪肝，所以目前缺乏行之有效的針對性診斷、治療方案[18-20]。

腸道菌群失調在NAFLD及相關代謝紊亂中發揮重要作用。肝臟與胃腸道同為消化系統重要組成部分，由于肝臟與腸道特殊的解剖生理關系，腸道微生物通過肝-腸循環，在肝損傷、慢性纖維化、炎癥及腫瘤發生發展中發揮重要作用[21-22]。SCFA是具有1～6個碳原子的有機脂肪酸，由腸道內微生物發酵膳食纖維產生，產生SCFA的腸道微生物主要包括厭氧類桿菌、真桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌，受發酵底物、細菌種類等因素的影響，產生SCFA的種類、數量不同，在腸道內發揮的作用也不相同[23-24]。由此可見SCFA的形成與上述腸道微生物密切相關，進一步的研究[25]表明SCFA是飲食和腸道菌群在腸道微環境中相互作用的結果，是介導飲食、腸道菌群、宿主之間的信號因子，在機體免疫系統、代謝系統及內分泌系統等方面發揮重要作用。有研究[26]表明，SCFA與腸易激綜合征、肝癌、結直腸癌、NAFLD等消化系統疾病有著密切聯系。

眾多研究[27-28]表明NAFLD促進了T2DM及其并發癥的發展，而T2DM加劇了NAFLD的嚴重程度及脂代謝紊亂，已被越來越多的人所認識。另外有研究[29]顯示超重/肥胖也與NAFLD息息相關，即肥胖與NAFL、NASH、相關肝硬化和肝細胞癌相關。一項基于健康人群NAFLD患病率及危險因素調查結果[30]顯示NAFLD組超重或肥胖、T2DM、血脂異常、尿酸升高、血黏度異常、肝損傷的發生率均高于對照組，存在顯著差異。本研究結果顯示NAFL組、NASH組、非酒精性脂肪性肝纖維化組BMI、FPG、TG、DB、CAP均高于健康組，IBil、Alb、APTT低于健康組，差異有統計學意義(P<0.05)，與眾多研究結果基本一致。此外本研究還表明非酒精性脂肪性肝纖維化組及NASH組相關肝功能指標較NAFL組升高，可以推測兩組患者可能存在更加嚴重的肝損傷；另外，非酒精性脂肪性肝纖維化組的LSM較NAFL組、NASH組均高，說明LSM具有廣泛的應用價值，在評估肝纖維化程度方面表現良好，與Eddowes、Vuppalanchi等[31-32]研究結果一致。基于之前的實驗結果，NAFLD患者確實存在不同程度的腸道菌群紊亂，假設NAFLD患者的腸道菌群代謝產物也因此受到影響，進一步利用GC-MS進行代謝組學分析。本研究選擇糞便SCFA進行檢測，發現非酒精性脂肪性肝纖維化組戊酸、己酸含量顯著高于對照組，NAFL組戊酸、己酸含量顯著低于對照組(P值均<0.05)；非酒精性脂肪性肝纖維化組戊酸、己酸含量顯著高于NAFL組，非酒精性脂肪性肝纖維化組戊酸含量顯著高于NASH組(P值均<0.05);NASH組己酸含量顯著高于NAFL組(P值均<0.05)。各組間乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸含量無顯著性差異(P值均>0.05)。據此可以推測戊酸、己酸可能促進NAFLD 病程進展，機制可能是通過肝-腸循環，促進肝損傷、慢性纖維化、炎癥的發生發展，但本研究中NAFL組戊酸、己酸含量卻低于健康對照組，推測可能與疾病初步進展，機體戊酸、己酸含量尚未產生明顯變化有關，另外程靖等[33]利用HFD小鼠誘導NAFLD模型并檢測其SCFA的變化，結果顯示實驗組糞便乙酸、丙酸和總SCFA水平明顯降低，與本研究實驗結果不一致，推測可能與實驗檢測誤差及樣本量偏小相關。本研究進一步分析疾病嚴重程度與SCFA的相關性，發現疾病嚴重程度與丁酸、戊酸、己酸顯著正相關，與前文研究結果相對應。

目前臨床針對NAFLD患者缺乏特異性藥物，本研究基于臨床現狀，選取NASH組高危患者10例治療干預(服水飛薊賓膠囊 105 mg/次、3 次/d及每日晨起進行有氧運動 1 h)3個月后隨訪并檢測血清學指標及糞便SCFA含量的差異。本研究結果顯示NASH患者治療后HbA1c、FPG、TG、TC、ALT、AST、GGT、TBA、PT、UA、CAP、LSM均明顯低于治療前(P值均<0.05)，治療前后ALP、TBil、DBil、IBil、Alb、Glb、APTT差異無統計學意義(P值均>0.05)。NASH患者10例治療后乙酸、丙酸含量均高于治療前(P值均<0.05)，治療后異丁酸含量低于治療前(P<0.05)，治療前后丁酸、異戊酸、戊酸、己酸差異無統計學意義(P值均>0.05)，Pingitore等[11]研究表明乙酸鹽可減輕NASH小鼠的肝臟脂肪變性和炎性浸潤，并降低血清中TG、游離脂肪酸和膽固醇的水平；丙酸可通過抑制β細胞凋亡而增強葡萄糖刺激的胰島素釋放，與本研究結果一致，推測乙酸、丙酸可能通過參與脂肪代謝相關基因的表達，通過腸-肝軸減少腸道黏膜通透性，減少內毒素的移位，可能對NAFLD患者肝臟存在一定程度的保護作用，此外，本研究結果顯示異丁酸含量低于治療前，推測異丁酸可能參與NASH的發生發展，目前異丁酸對NAFLD研究較少，缺乏相應文獻支持，期待更進一步的研究。另有研究[34]表明，丁酸產生的益生菌能糾正HFD引起的小鼠腸肝免疫失調和減輕脂肪性肝炎，本研究結果顯示治療前后丁酸無統計學差異，需要更進一步的研究證實。此外，本研究結果中HbA1c、FPG、TG、TC、ALT、AST、GGT、TBA、PT、UA、CAP、LSM等臨床指標治療后均明顯低于治療前，乙酸、丙酸含量均高于治療前，推測乙酸、丙酸對肝臟的保護作用可能進一步導致血清學相關指標的降低。

目前研究表明，在進展至非酒精性脂肪性肝纖維化之前，NAFL與NASH是可逆的，一旦進展為肝硬化則不可逆，可能進一步發展為肝癌，目前臨床對于非酒精性脂肪性肝纖維化的診斷依賴于影像學檢查，如腹部彩超、CT、MRI等，肝穿刺活檢仍然是目前確診非酒精性脂肪性肝纖維化的金標準。超聲作為篩查手段，具有無創、簡易、價格低等優點，但只能檢測出>30%的脂肪變性，且不能做出定量評估，存在局限性；CT可以精確檢測出脂肪變，但此方法針對輕度脂肪變較為敏感，加之具有電離輻射，具有一定局限性；MRI雖無輻射，但其對脂肪肝診斷尚缺乏大量臨床試驗，且價格昂貴，不宜多次重復檢測；肝穿刺活檢為有創性檢查且脂肪變不均勻會有取材誤差，還存在禁忌證等限制；臨床常用血清肝纖維化四項檢查一般耗時較長等特點，臨床亟需一種無創、簡便、價格低廉的方法。

本研究基于SCFA及PⅢP N-P、Ⅳ-C、HA、LN對非酒精性脂肪性肝纖維化診斷繪制ROC曲線，可以看出戊酸、己酸、PⅢP N-P、Ⅳ-C、HA對非酒精性脂肪性肝纖維化診斷價值較高，血清肝纖四項作為評估肝纖維化程度的可靠指標在臨床廣泛應用，本研究得出PⅢP N-P、Ⅳ-C、HA三者診斷價值較高，但LN診斷能力有限，推測可能PⅢP N-P、Ⅳ-C、HA早期明顯升高，HA后期才顯著增高有關，還可能與樣本量偏少，代表性不足有關，期待后續更大樣本量的研究。本研究進一步對比戊酸、己酸與PⅢP N-P、Ⅳ-C、HA對非酒精性脂肪性肝纖維化診斷價值，可以看出戊酸、己酸診斷價值劣于PⅢP N-P，但優于Ⅳ-C、HA，推測戊酸、己酸可以作為非酒精性脂肪性肝纖維化的輔助診斷指標，進一步根據約登指數最大值對應的檢驗變量值(戊酸為141.42 μg/g、己酸為6.93 μg/g、PⅢP N-P為68.06 ng/ml、Ⅳ-C為60.12 ng/mL、HA為104.46 ng/mL)作為診斷臨界值，期待可以為臨床非酒精性脂肪性肝纖維化的診斷提供一定的參考價值。

綜上所述，NAFLD患者存在生化指標及腸道菌群代謝產物SCFA的異常，說明SCFA代謝狀態的改變可以影響疾病進程。腸道菌群代謝產物SCFA在NAFLD早期診斷和治療中具有重要的作用和應用前景。但是由于本實驗樣本量偏少，后續還需要進一步開展更大樣本的研究，進一步探討SCFA腸道代謝與NAFLD發病機制的關系。

倫理學聲明：本研究2019年8月1日通過青海大學附屬醫院倫理委員會審批，批號為P-SL-201958，患者及家屬均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：李惠、王學紅、馬臻棋參與研究的思路設計，修改文章關鍵內容；馬文霞、楊麗萍參與研究數據的獲取過程。