基于高通量測序分析涼血解毒方對HBV相關慢加急性肝衰竭患者腸道菌群的影響

侯藝鑫， 張 群， 江宇泳， 于 浩， 楊玉英， 王憲波

首都醫科大學附屬北京地壇醫院 中西醫結合中心， 北京 100015

慢加急性肝衰竭(ACLF)的臨床表現以極度乏力、嚴重消化道癥狀、黃疸、腹水及凝血功能障礙為主，突出的病理表現為廣泛肝細胞壞死[1]，病死率極高(50%～90%)[2-4]，目前，仍然是世界性難題。在我國，HBV感染所致ACLF最為多見，約占90%左右[5]，一旦發生ACLF，目前尚缺乏特效藥物。

近年來，人們對腸道菌群的認識逐漸深入。越來越多的研究通過16S rDNA和宏基因組等技術揭示出腸道菌群在慢性肝臟疾病中的改變[6]。北京地壇醫院中西醫結合中心以診治肝病為特色，多年來在中醫藥治療肝衰竭方面不斷的探索和總結，尤其在治療HBV相關ACLF(HBV-ACLF)方面積累了豐富的經驗。基于ACLF“熱、毒、瘀”的核心病機及病證癥相結合的治療理念，中西醫結合中心創立了“涼血解毒重通腑，健脾化濕顧中焦”的治療法則，并且在治療用藥方面獨具匠心。本研究采用體外模擬發酵實驗的方法分析涼血解毒方治療ACLF的腸道菌群特征，為進一步研究涼血解毒方治療HBV-ACLF的作用機制奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年10月—2019年10月于本院中西醫結合中心住院的HBV-ACLF患者，根據是否加涼血解毒方，分為HBV-ACLF用藥組與HBV-ACLF未用藥組。另選取同期健康志愿者作為對照(HP組)。

1.2 納入標準 HBV-ACLF入組標準：(1)診斷標準參考《肝衰竭診治指南(2012年版)》[7]；(2)年齡18～65歲。HP組納入標準：在本院住院HBV-ACLF患者家屬中，招募與疾病對象年齡、性別、地域相匹配的健康志愿者，病史調查顯示身體健康，無肝臟和胃腸道疾病史，既往無高血壓、糖尿病等其他系統性疾病，6個月內無手術史，肝腎功能無異常。

1.3 排除標準 重疊HAV、HCV、HEV等感染；合并自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、酒精性肝病及各種遺傳代謝性肝病；合并結核感染；HIV感染者；有嚴重心、腎等并發癥或合并其他原發性疾病者；惡性腫瘤患者；上消化道出血；肝腎綜合征；妊娠或哺乳期婦女；近1個月內應用過抗生素或益生菌；飲食習慣特殊者，例如素食者。

1.4 材料

1.4.1 主要儀器 移液器(Eppendorf N13462C Eppendorf)；小型離心機[ABSON MiFly-6，合肥艾本森科學儀器有限公司(中國)]；PCR儀[ABI GeneAmp?9700型，ABI(美國)]；測序儀[Illumina Miseq，Illumina(美國)]等。

1.4.2 試劑 涼血解毒方(茵陳30 g、梔子15 g、生地15 g、生黃芪15 g、赤芍30 g、丹參15 g、丹皮15 g、升麻15 g、白術15 g、茯苓15 g、黃芩15 g，批號：190631-1，北京康仁堂藥業有限公司訂購免煎顆粒劑)；DNA抽提試劑盒[E.Z.N.A.?Soil DNA Kit，Omega Bio-Tek(美國)]；建庫試劑盒[NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit，Bioo Scientific(美國)]；測序試劑盒[MiSeq Reagent Kit v3，Illumina(美國)]等。YCFA培養基(酪胨10 g/L，酵母提取物2.5 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.8 g/L，血紅素0.05 g/L，NaCl 4.5 g/L，CaCl2·6H2O 0.09 g/L，KH2PO40.45 g/L，K2HPO40.45 g/L，MgSO4·7H2O 0.09 g/L)。

1.5 研究方法和步驟

1.5.1 糞便樣本的采集和處理 收集新鮮糞便，30 min內送到實驗室，立即置于超凈工作臺進行處理，挑取中心部位糞便樣本(防止外源細菌污染以及腸壁細胞干擾)2 mL短時間內進行體外模擬發酵實驗。

1.5.2 涼血解毒方對HBV-ACLF患者腸道菌群干預的體外模擬發酵實驗

1.5.2.1 取樣、接種與厭氧培養 本研究嚴格按照上述納排標準收集了HBV-ACLF患者的新鮮糞便樣本，樣本采集后短時間內置于超凈臺并分取4份，每份約0.5 g，然后加入到含0、10%、50%、100%中藥的培養基(表1)中混勻，立即放置在厭氧罐中厭氧培養24 h。

表1 含有不同涼血解毒方濃度的培養基配方

1.5.2.2 培養后樣本處理 (1)過濾：將無菌漏斗置于50 mL離心管上，用無菌紗布將培養好的糞便菌液進行過濾以濾除糞便沉渣。(2)保菌：取1 mL菌液加入含有500 μL甘油(50%)的離心管中，混勻，-80 ℃凍存。(3)離心：高速離心機離心(12 000 r/min，15 min)，分裝上清和沉菌，-80 ℃凍存。

1.5.3 糞便及發酵沉菌的DNA提取 采用QIAamp DNA Mini Kit，具體按照試劑說明書進行操作。

1.5.4 糞菌群16S rDNA 測序分析 本研究所涉及的Illumina平臺MiSeq高通量測序由海歐易生物醫學科技有限公司完成。

1.5.5 生物信息學分析 (1)測序數據處理；(2)操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類；(3)分類學分析；(4)多樣性分析；(5)樣本層次聚類分析；(6)微生物多元變量統計分析。

2 結果

2.1 一般資料 共納入HBV-ACLF患者10例，其中HBV-ACLF用藥組5例，未用藥組5例；健康志愿者15例。HP組與HBV-ACLF組的基本信息見表2。兩組年齡、BMI比較差異均無統計學意義(t值分別為2.110、4.256，P值均>0.05)。

表2 兩組研究對象的一般資料

2.2 測序數據 本研究共收集25個樣本，質控之后的空白clean tags數據量分布在38 009～41 802，clean tags經過去除嵌合體得到有效數據valid tags(即最終用于分析的數據)數據量分布在32 184～37 043，valid tags平均長度分布在409.92～432.39 bp，各樣本OTU個數分布在300～536。每個樣本的tags信息見表3。

表3 每個樣本信息表

2.3 HBV-ACLF未用藥組與HP組腸道菌群多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性 結果顯示，HBV-ACLF患者腸道中微生物物種的豐富度降低，菌群多樣性降低。(1)衡量菌群豐度的Chao指數：HBV-ACLF未用藥組的Chao指數顯著低于HP組[587.5(575.0～625.0) vs623.5(524.0～673.5)，Z=3.876，P=0.036](圖1a)。(2)衡量群落多樣性的Shannon指數：HBV-ACLF未用藥組的Shannon指數顯著低于HP組[4.00(3.52～4.23) vs 4.62(4.24～5.13)，Z=2.876，P=0.028](圖1b)。(3)衡量菌群多樣性的Simpson指數：HBV-ACLF未用藥組的Simpson指數顯著低于HP組[0.84(0.78～0.88) vs 0.90(0.87～0.94)，Z=3.563，P=0.049](圖1c)。

注：a，Chao指數；b，Shannon指數；c，Simpson指數。

2.3.2 物種累積曲線 物種累積曲線顯示，隨著樣本量的增加，曲線趨于平緩，表明該研究中的物種并不會隨樣本量的增加而顯著增多，測序樣本量足以反映樣本中的絕大多數微生物信息(圖2)。

圖2 物種累積曲線

2.4 HBV-ACLF未用藥組與HP組菌群比較 HBV-ACLF未用藥組與HP組之間各個分類水平均存在一定的差異，運用OTU進行分析，可反映在門、綱、目、種、屬等各分類水平上各樣本的物種分類情況。在門水平，采用t檢驗，兩組之間存在3種菌群差異[擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)]；采用Wilcoxon檢驗，兩組之間存在2種菌群差異[擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)]；尤其在屬水平，采用Wilcoxon檢驗，兩組之間存在77種菌群差異。具體差異物種統計匯總見表4。

表4 各個水平菌群比較

根據OTU分析，在門分類水平和屬分類水平上通過柱狀圖反映腸道菌種情況，可以呈現不同物種在每例患者所占的比例以及兩組不同的菌種。結果顯示，HP組每個樣本均以擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)為主，HBV-ACLF未用藥組擬桿菌門(Bacteroidetes)明顯減少，梭桿菌門(Fusobacterio)、變形菌門(Proteobacteria)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)增多(圖3)。HBV-ACLF未用藥組瘤胃菌(Ruminococus)、布勞特菌屬(Blautia)、真桿菌屬(Eubacterium)較HP組明顯減少，而副桿菌屬(Parabacteroides)、乳酸桿菌(Lactobacllus)、梭桿菌(Fusobacterio)、鏈球菌(Streptococcus)較HP組增多(圖4)。

注：a，不同門分類在每個病例中所占的比例；b，HBV-ACLF未用藥組和HP組3種門分類的比較。Actinobacteris，放線桿菌門；Epsilonbacteraeota，表皮菌門；Tenericutes，馬鞭菌門；Gemmatimonadetes，芽單孢菌門；Cynobacteria，嗜肺桿菌門；Acidobacteria，酸桿菌門；Nitrospirae，硝基繡線菌門；Spirochaetes，螺旋體菌門；Deferribacteres，脫鐵桿菌門；Laescibacteria，不動桿菌門；Fibrobacteres，纖維桿菌門；Fusobacterio，梭桿菌門；Proteobacteria，變形菌門。

注：Eubacterium coprostanoligenes，糞甾烷內酯真桿菌屬；Eubacterium hallii-group，真桿菌屬；Agathobacter，陰溝桿菌屬； Agathobacter Blautla，布勞特菌屬；Fusobacterium，梭桿菌屬；Lactobacllus，乳酸桿菌；Parabacteroides，副桿菌屬；Ruminococcus，瘤胃菌；Streptococcus鏈球菌屬；uncultured-bacterium,未增養菌。

2.5 腸道菌群聚類分析 聚類分析結果整體趨勢表現為病種相同的研究對象大致聚類到一起，提示病種相同者腸道菌群構成相似，即HBV-ACLF患者腸道菌群構成相似，HP組腸道菌群構成相似(圖5)。

注：a，整體趨勢；b，聚類分析。

2.6 涼血解毒方對HBV-ACLF患者腸道菌群多樣性的影響 采用Shannon指數衡量HBV-ACLF患者腸道菌群多樣性。結果顯示，HBV-ACLF用藥組(涼血解毒方含藥濃度10%、50%、100%)Shannon指數[5.00(4.80～5.20)、5.30(4.78～6.12)、5.50(4.86～6.28)]較HBV-ACLF未用藥組[3.80(3.00～4.12)]顯著升高(Z值分別為2.443、3.374、3.235，P值分別為0.013、0.039、0.018)，且隨著含藥濃度升高，Shannon指數逐漸升高，表明涼血解毒方能夠恢復HBV-ACLF患者腸道菌群的多樣性，且含藥濃度越高，效果越明顯(圖6)。

圖6 不同濃度涼血解毒方對腸道菌群Alpha多樣性的影響

2.7 涼血解毒方對差異性菌屬的影響 為了解涼血解毒方對HBV-ACLF患者腸道菌群構成的影響，從屬分類水平進行了比較分析，結果顯示：HBV-ACLF用藥組瘤胃菌(Ruminococus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、擬桿菌(Bacteroidetes)、氏菌屬(Genusgenus)相對豐度值較HBV-ACLF未用藥組顯著升高(圖7b、d、f、h)，而梭桿菌(Fusobacterio)、變形菌(Proteobacteria)較未用藥組顯著降低(圖7j、l)(P值均<0.05)。

與HP組相比，HBV-ACLF未用藥組瘤胃菌(Ruminococus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、擬桿菌(Bacteroidetes)、氏菌屬(Genusgenus)相對豐度值明顯降低(圖7a、c、e、g)，梭桿菌(Fusobacterio)、變形菌(Proteobacteria)相對豐度值明顯升高(圖7i、k)(P值均<0.05)。

3 討論

ACLF是在慢性肝病基礎上，引起短期內急性或者亞急性肝功能失代償的臨床癥候群，病情危重，短期病死率極高，預后差[8]。目前關于ACLF的病理機制尚不清楚，但近幾年越來越多研究表明腸道細菌易位是引起ACLF很重要的原因[9]。然而目前缺乏ACLF患者腸道菌群相關的研究。

本研究運用16S rDNA通量測序法對HBV-ACLF患者和健康人群的腸道菌群進行測序分析，結果顯示兩組人群中腸道菌群具有顯著差異。腸道菌群的多樣性和豐度是衡量腸道菌群是否平衡的重要指標[10]。本研究發現，衡量患者腸道菌群豐度的Chao指數在HBV-ACLF患者中顯著降低；衡量多樣性的Shannon指數在HBV-ACLF患者中顯著降低。進一步分析腸道菌群門、屬水平的分類學特征性改變，發現HBV-ACLF患者與健康人群有顯著差異。HBV-ACLF未用藥組腸道菌群發生了廣泛的群落改變。大量潛在致病菌如副桿菌屬(Parabacteroides)、乳酸桿菌(Lactobacllus)、梭桿菌(Fusobacterio)、鏈球菌(Streptococcus)等在HBV-ACLF患者中顯著升高。

注：a、c、e、g、i、k，HP組與HBV-ACLF未用藥組瘤胃菌(Ruminococus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、擬桿菌(Bacteroidetes)、氏菌屬(Genusgenus)、梭桿菌(Fusobacterio)、變形菌(Proteobacteria)菌群變化；b、d、f、h、j、l，HBV-ACLF不同涼血解毒方含藥濃度瘤胃菌(Ruminococus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、擬桿菌(Bacteroidetes)、氏菌屬(Genusgenus)、梭桿菌(Fusobacterio)、變形菌(Proteobacteria)菌群變化。

本研究還觀察到HBV-ACLF患者較健康人群中相對豐度降低的菌屬，如瘤胃菌(Ruminococus)、真桿菌屬(Eubacterium)，其中，瘤胃球菌屬是已知的產生短鏈脂肪酸的細菌[11]。短鏈脂肪酸能夠發揮保護腸道的作用，其保護機制可能與促進腸道絨毛的生長修復，為腸道黏膜提供營養，增強腸道免疫以及促進微生物生長，抑制致病菌相關[12-13]。

本研究采用體外模擬發酵實驗，進一步分析了涼血解毒方對HBV-ACLF患者腸道菌群構成的影響，結果發現：HBV-ACLF用藥組瘤胃菌(Ruminococus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、擬桿菌(Bacteroidetes)、氏菌屬(Genusgenus)較未用藥組顯著升高，而梭桿菌(Fusobacterio)、變形菌(Proteobacteria)較未用藥組顯著減少(P值均<0.05)。研究結果表明，涼血解毒方能有效增加腸道優勢菌，減少致病菌，從而恢復腸道正常菌群生物多樣性及豐度。毛螺菌、氏菌屬亦屬于短鏈脂肪酸細菌，同樣具有修復腸道黏膜的作用[14]。本研究中HBV-ACLF組兩種菌屬豐度顯著降低，涼血解毒方干預后明顯增多。擬桿菌[15]是人體腸道內常見的健康菌群之一，具有分解碳水化合物的作用，其減少可引起腸道消化不良。本研究中發現HBV-ACLF組患者擬桿菌明顯減少，應用涼血解毒方干預后，擬桿菌明顯增加，由此推測，涼血解毒方改善臨床癥狀的作用機制可能與調節腸道內擬桿菌水平相關。此外，本研究應用涼血解毒方干預后，HBV-ACLF用藥組較未用藥組梭桿菌屬及變形菌屬顯著減少，提示減少致病菌，從而有效降低炎癥反應，可能是涼血解毒方作用機制之一。

綜上所述，本研究發現HBV-ACLF患者腸道菌群較正常健康人群腸道菌群結構豐度及多樣性顯著下降；HBV-ACLF患者腸道菌群區別于正常人群，表現為潛在致病菌異常升高，潛在有益菌異常降低，二者倒置導致腸道菌群紊亂；紊亂的腸道菌群可能通過細菌易位增加感染風險、炎癥過度活化，故在HBV-ACLF發生發展過程中扮演重要角色。進一步體外模擬發酵實驗結果表明，涼血解毒方能有效增加優勢菌，減少致病菌，從而達到調節腸道菌群紊亂的作用，為進一步研究涼血解毒方治療HBV-ACLF的作用機制奠定基礎。

倫理學聲明：本研究方案于2018年10月29日經由北京地壇醫院倫理委員會審批，批號：2018第(036)-01號，所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：侯藝鑫、張群負責課題設計，資料分析，撰寫論文；江宇泳、于浩、楊玉英參與收集數據，修改論文；王憲波負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。