RVVC患者陰道微生物的物種組成及其變化情況

歐麗瀅?周琛斐?蔡慧華?劉木彪

【摘要】 目的 探討復發性外陰陰道假絲酵母菌病（RVVC）患者陰道微生物的物種組成及其變化情況。方法 招募6例RVVC患者，納入患者均在發作間期每日采集1份高位陰道拭子進行陰道微生物的物種檢測，并運用主坐標分析法（PCoA）、繪制樣品熱圖、α多樣性分析等方法分析RVVC患者陰道微生物的物種組成及其變化情況。結果 組間PCoA結果顯示RVVC患者陰道微生物物種在發作間期的組成相似，但在臨近發作期、發作日均出現物種差異增大的現象。樣品熱圖分析提示，在RVVC發作期和發作間期階段物種的距離較遠，并在臨近發作期的生物間差異性開始集中。RVVC患者陰道微生物物種組成結果分析顯示，乳酸桿菌占比為64.25%，相對豐度在0.10%～1.00%的菌屬有小類桿菌屬、腸桿菌科、大芬戈爾德菌、奇異菌屬、氣球菌屬、葡萄球菌屬、厭氧球菌和乳球菌，相對豐度> 1.00%的菌屬有乳酸桿菌屬、普雷沃菌屬、鏈球菌、加德納菌和脲原體。樣品α多樣性分析結果提示在RVVC發作間期的物種豐度基本相似，臨近發作期物種的豐度提升，在發作前大部分物種在較低的豐度水平。隨訪患者數個月經周期中以乳酸桿菌為絕對優勢菌屬，偶有波動但幅度不大，但在各組發作前均存在一過性的普雷沃菌增加，也存在加德納菌的增加，時而波動，其他菌屬（如小桿菌屬、大芬戈爾德菌、奇異菌屬、脲原體等）在月經期所占比例較低，偶有波動，其余菌屬在月經周期維持在較低豐度水平。結論 RVVC患者陰道微生物以乳酸桿菌為主，陰道菌群相對穩定、波動性弱，臨床對其治療應注重陰道微生態環境的調理，或可通過恢復陰道菌群比例，達到治愈RVVC的目的。

【關鍵詞】 復發性外陰陰道假絲酵母菌病;陰道微生物;物種組成;動態變化

Species composition and dynamic changes of vaginal microbiota in patients with recurrent vulvovaginal candidiasis Ou Liying△， Zhou Chenfei， Cai Huihua， Liu Mubiao. △The Second School of Clinical Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510260， China

Corresponding author， Liu Mubiao， E-mail： liumb1972@126.com

【Abstract】 Objective To investigate the species composition and dynamic changes of vaginal microbiota in patients with recurrent vulvovaginal candidiasis （RVVC）. Methods Six patients with confirmed symptomatic RVVC were enrolled in this study. During the onset of RVVC， 1 high vaginal swab sample was collected from each patient on a daily basis to identify the vaginal microbiota. Principal co-ordinate analysis （PCoA）， thermogram analysis and α diversity analysis were adopted to analyze the species composition and dynamic changes of vaginal microbiota in RVVC patients. Results PCoA analysis between groups showed that the species composition of vaginal microbiota in patients with RVVC was similar at the interval between onset， but the species difference was increased at several days before the onset and on the day of onset. Thermogram analysis suggested that the distance between microbiota was large in the onset stage and at the interval between onset of RVVC， and the intermediate difference of microbiota began to converge at several days before the onset stage. The species composition analysis of vaginal microbiota in patients with RVVC showed that Lactobacillus accounted for 64.25%. Bacterial genera with relative abundance between 0.10% and 1.00% included Dialister， Enterobacteriaceae， Finegoldia magna， Atopobium， Aerococcus， Staphylococcus， Anaerococcus and Lactococcus. The genera with relative abundance of >1.00% consisted of Lactobacillus， Prevotella， Streptococcus， Gardnerella and Ureaplasma. The α diversity index evaluation results indicated that the species abundance at the interval between onset of RVVC was similar， which was increased approaching the onset stage， and most returned to a low level of species abundance before the onset. Lactobacillus was the absolute dominant genus during several menstrual cycles of patients receiving follow-up， with small fluctuations. However， there was a transient increase of Prevotella in each group before the onset， and there was also an increase in Gardnerella， which occasionally fluctuated. The proportion of the other genera such as Dialister， Finegoldia magna， Atopobium and Ureaplasma was relatively low， and with few fluctuations. The remaining genera remained at a low level during the menstrual cycle. Conclusions Lactobacillus is the main vaginal microbiota in patients with RVVC. Vaginal microbiota in RVVC patients are relatively stable， with few fluctuations. In clinical treatment， widespread attention should be diverted to the regulation of vaginal microecological environment and restoring the proportion of vaginal microbiota.

【Key words】 Recurrent vulvovaginal candidiasis; Vaginal microbiota; Species composition; Dynamic change

復發性外陰陰道假絲酵母菌病（RVVC）是復雜性外陰陰道假絲酵母菌病的一種，指患者經過治療后臨床癥狀和體征消失，且真菌學檢查陰性，但仍有外陰瘙癢、排尿疼痛、陰道分泌物等癥狀，據報道約5%成年婦女有RVVC[1-2]。RVVC病因復雜、頑固不愈，其治療策略成為臨床研究熱點[3]。RVVC的病原體中80%～90%為白色假絲酵母菌，研究發現RVVC發作期中假絲酵母菌數量增加，乳酸桿菌比例明顯降低[4]。但也有學者認為指乳酸桿菌的減少并不會增加RVVC的發生風險，乳酸桿菌并非是假絲酵母菌的有效拮抗生物[5]。另有學者提出，假絲酵母菌和陰道菌群之間的失衡可能是發生RVVC的主要因素[6]。現階段有關于RVVC陰道菌群特征的研究也有一定的爭議[7]。近年基因組學分析顯示，RVVC患者的陰道菌群與健康女性患者的陰道菌群間并無明顯差異，且RVVC患者乳酸桿菌豐度并未明顯下降，陰道菌群結構也無明顯改變[8]。目前的研究結論并不能顯示患者在RVVC發作間期陰道微生物物種的動態變化，同時現階段對于陰道微生態系統和RVVC發作之間是否有關尚無定論。為此，本研究著重建立動態隊列，并對樣本不斷取材，以期能夠捕捉到RVVC發作間期及發作期的陰道微生物菌群結構的變化，為RVVC患者的靶向治療提供參考。

對象與方法

一、研究對象

采取自愿原則，招募2017年在廣東省人民醫院婦科就診的6名確診為RVVC的患者為研究對象，分別記為RV-A～RV-F。患者年齡（37.21±6.14）歲。納入標準：①已婚女性，年齡20～49歲;②有RVVC臨床癥狀和體征，如外陰瘙癢、外陰灼痛、性交痛或尿痛、外陰紅斑和水腫等，專科檢查見外陰紅腫、抓痕及外陰黏膜黏附有白色膜狀物或陰道內有較多豆腐渣樣分泌物;③實驗室檢查見假絲酵母菌的芽生孢子或假菌絲，或真菌培養陽性;④1年內有上述癥狀且經真菌學檢查證實發作4次或以上，本次就診治療后返院且陰道分泌物真菌學復查結果陰性且未合并其他陰道炎癥。排除標準：①既往有活動性細菌性陰道炎;②處于妊娠期或哺乳期;既往使用過免疫抑制類藥物;③月經不規律或絕經;④入組前1周內服用過抗菌藥物或抗真菌類藥物;⑤有全身系統性疾病。本研究方案經廣東省人民醫院醫學倫理委員會批準（批件號：2017230H），入組患者均已簽署知情同意書。

二、方 法

1. 治療方法

入組患者每次復發后均予鹽酸特比萘芬陰道泡騰片治療，50 mg/d，持續用藥7 d。以留取高位陰道拭子（HVS）的首日作為入組的第1日，以患者RVVC再次發作日為觀察終點。按每例患者留取陰道拭子的先后順序編號，共取得235份陰道拭子進行測序，其中RV-A 24份（記為A1～A24）、RV-B 25份（記為B1～B25）、RV-C 75份（記為C1～ C75）、RV-D 29份（記為D1～29）、RV-E 54份（記為E1～E54）、RV-F 28份（記為F1～F28）。

2. RVVC患者陰道微生物的物種檢測

采用生工生物工程（上海）股份有限公司的細菌基因組 DNA 快速抽提試劑盒，按試劑盒說明書步驟抽提陰道拭子中的細菌DNA，應用微生物多樣性建庫測序流程檢測微生物種類。通過使用BIPES流程對樣本數據進行分析，隨后使用UCHIME對嵌合體序列進行摘除，6例RVVC患者的樣本數量為235份，測序共獲得18 273 380對序列，經對雙端序列質控、拼接后共產生16 192 661條高質量序列，每份樣本至少產生39 517條高質量序列，平均產生68 905 條高質量序列。

三、統計學處理

應用R語言基于β多樣性得到的矩陣繪制組間主坐標分析法（PCoA）圖。基于4種距離算法[binary jaccard、bray curtis、unweighted Unifrac（限細菌）、weighted Unifrac（限細菌）]及R語言繪制樣品熱圖，將數據進行物種或樣品間豐度相似性聚類，再通過顏色梯度的變化直觀地看出兩兩樣品間的差異性。顏色梯度由藍色到紅色的變化表示樣品間距離由近到遠，即兩兩樣品間的差異由小到大變化。細菌多樣性和豐度圖分別使用α多樣性和堆積條形圖制作。Shannon指數用于估算樣品中微生物多樣性，Shannon指數值越大，說明群落多樣性越高。采用單因素方差分析比較6例RVVC患者Shannon指數間的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。使用MicrobiomeAnalyst創建微生物組圖。其他數據和分析均使用GraphPad Prism。

結 果

一、PCoA分析

R語言繪制的PCoA基于β多樣性分析得到矩陣，展示樣品間物種多樣性差異，結果顯示RVVC患者發作間期的物種組成相似，但在臨近發作期及發作日均出現物種差異增大的現象，見圖1。

二、樣品熱圖分析

RVVC發作期和RVVC發作間期兩者物種的距離較遠，代表其生物的差異較大，而在發作期的前幾日，其生物的中間差異開始靠攏，見圖2。6例RVVC患者中的部分圖例分析見圖3。

三、RVVC患者陰道微生物的物種組成

6例RVVC患者陰道微生物物種組成分析結果顯示，占比在0.10%～1.00%的菌屬有小類桿菌屬（0.98%）、腸桿菌科（0.97%）、大芬戈爾德菌（0.94%）、奇異菌屬（0.91%）、氣球菌屬（0.85%）、葡萄球菌屬（0.81%）、厭氧球菌（0.64%）和乳球菌（0.14%），而占比> 1.00%的菌屬包含乳酸桿菌（64.25%）、普雷沃菌屬（10.64%）、鏈球菌（8.24%）、加德納菌（3.27%）和脲原體（1.84%）。

四、樣品α多樣性分析

RVVC患者發作間期的物種豐度基本相似，臨近發作期均存在物種豐度的提升，發作前大部分又恢復在較低的物種豐度水平，見圖4。6例Shannon指數比較差異有統計學意義（F = 13.205，P < 0.001），其中RV-D、RV-B組內多樣性較低，RV-A次之，RV-C、RV-E、RV-F的α多樣性較高，見圖5。發作期前（RV-A發作前5～6 d、RV-B發作前1～4 d、RV-C發作前6～7 d、RV-D發作前5～8 d、RV-E發作前1～3 d、RV-F發作前5～6 d）存在物種豐度提升情況，臨近發作期（發作前1～2 d）大部分又恢復在較低的物種豐度水平，見圖6。

五、RVVC患者陰道微生物的物種動態變化

對RVVC患者個體進行動態菌譜圖分析，在隨訪患者數個月經周期中以乳酸桿菌為絕對優勢菌屬，偶有波動但幅度不大，但在各組發作前均存在一過性的普雷沃菌屬增加，也存在加德納菌屬的增加，時而波動，其他菌屬（如小桿菌屬、大芬戈爾德菌、奇異菌屬、脲原體等）在月經期所占比例較低，偶有波動，其余菌屬在月經周期維持在較低豐度水平，見圖7。

討 論

據不完全統計，2015年全球陰道假絲酵母菌病（VVC）患病人數高達1.38億，約4.92億女性曾罹患VVC，近年來VVC發病率有上升趨勢[9]。現階段臨床針對VVC的治療以局部抗真菌藥物為主，但疾病的反復性成為患者康復的難點，積極探求針對RVVC病因的靶向治療方案是目前臨床急需解決的難題[10]。機體免疫因素、治療不規范及耐藥菌株的產生等被視為RVVC的可能病因，假絲酵母菌是RVVC的重要病原體，通常情況下假絲酵母菌以孢子相與陰道菌群處于共生狀態，共同維持陰道內微環境的動態平衡和女性生殖健康[11]。陰道微生態環境變化與RVVC的發生發展密切相關，有報道顯示RVVC發作期陰道乳酸桿菌明顯減少，在抗真菌治療基礎上及時補充乳酸桿菌，有利于患者陰道微生態平衡的恢復，對減輕患者臨床癥狀和降低RVVC復發率有積極意義[12]。有研究者指出，RVVC患者乳酸桿菌豐度并不高，與健康女性陰道菌群的組成并無明顯差異，且證實乳酸桿菌的缺失并不明顯增加RVVC患病風險[13]。但上述研究多為橫斷面研究且樣本采集時間點存在差異，較難體現出RVVC患者致病病原體的動態變化過程。

既往研究多數采用清潔度來判斷陰道炎癥性疾病，但清潔度判斷指標中的白細胞計數、上皮細胞計數僅可反映炎癥的情況，并不能對患者的發病起到一定的預測作用，因此其在臨床中的應用效果并不理想[14]。普遍認為陰道微生物與人體微環境保持動態平衡，評估RVVC患者陰道微生物的物種組成及其動態變化對指導其治療有重要的臨床指導意義[15]。有報道指出，RVVC患者陰道菌群的多樣性有所降低，但多數RVVC患者的陰道優勢菌屬是乳酸桿菌[16]。本研究中通過對RVVC患者進行連續隨訪，并采集患者陰道分泌物觀察RVVC發作前和發作過程中陰道菌群波動，以明確RVVC的最佳治療時間，結果顯示本組RVVC

患者陰道環境的優勢菌群與既往報道的基本吻合，女性陰道中微環境中乳酸桿菌屬占比最高（64.25%），占比在0.10%～1.00%間菌屬有小類桿菌屬、大芬戈爾德菌、奇異菌屬等，而占比超過1.00%的菌屬有乳酸桿菌屬、普雷沃菌屬、鏈球菌等，這些微生物在正常情況下可相互影響并保持一定比例，維持陰道微生態的動態平衡[17]。此外本研究還顯示，在隨訪患者數個月經周期中，以乳酸桿菌為絕對優勢菌屬，偶有波動但幅度不大，在各組發作前均存在一過性的普雷沃菌屬增加，也存在加德納菌屬的增加，時而波動，其他菌屬（如小桿菌屬、大芬戈爾德菌、奇異菌屬、脲原體等）在月經期所占比例較低，偶有波動，其余菌屬在月經周期維持在較低水平。由此推測普雷沃菌屬和加德納菌的繁殖或許可為假絲酵母菌提供一定的生存空間，但具體作用需要代謝組學的相關支持，在日后將進一步研究驗證。另外，在月經周期和藥物治療情況下，RVVC患者陰道菌群波動甚微，提示RVVC患者陰道菌群對內外因素的干擾反應較小，菌群波動性較弱，提示陰道微生物系統失衡可能存在于整個RVVC發生發展階段，由此初步說明一旦VVC進展成為RVVC，患者治愈的難度將明顯增加，對于VVC患者的抗微生物藥物治療需規范且足量才能防止疾病的復發。

綜上所述，RVVC患者的陰道菌群相對穩定，波動性減弱，且多數患者陰道微生物以乳酸桿菌為優勢菌屬，治療中需重視陰道微生態環境的調理。但本研究仍存在局限性，如研究患者例數少，加之考慮到失訪率及隨訪依從性問題，本次隨訪時間并不長，數據的同質性和異質性尚存疑。后續將針對性地對RVVC患者陰道菌群開展代謝組學研究，進一步探尋差異基因以明確具體的發病機制，為RVVC的靶向治療提供參考。

參 考 文 獻

[1] Lines A， Vardi-Flynn I， Searle C. Recurrent vulvovaginal candidiasis. BMJ， 2020， 369： m1995.

[2] Rolo J， Faria-Gon?alves P， Barata T， et al. Species distribution and antifungal susceptibility profiles of isolates from women with nonrecurrent and recurrent vulvovaginal candidiasis. Microb Drug Resist， 2021， 27（8）： 1087-1095.

[3] 陳秋珍， 嚴少梅， 黃麗婷， 等. 克霉唑陰道片治療復發性外陰陰道假絲酵母菌病療效分析. 中國實用婦科與產科雜志， 2021， 37（3）： 384-387.

[4] 劉輝煌. 乳酸菌陰道膠囊聯合克霉唑治療復發性外陰陰道假絲酵母菌病的療效與安全性分析. 中國微生態學雜志， 2020， 32（2）： 207-210.

[5] 張展， 白會會， 王風娟， 等. 復發性外陰陰道假絲酵母菌病患者反復發作期陰道分離菌株的同源性及耐藥性分析. 中華婦產科雜志， 2020， 55（3）： 177-182.

[6] 李賽男， 祁文瑾， 黃蓉， 等. 復發性外陰陰道假絲酵母菌病藥物敏感性與耐藥基因表達的相關性分析. 現代婦產科進展， 2021， 30（5）： 350-354， 359.

[7] 范琳媛， 白會會， 劉朝暉， 等. 544例外陰陰道假絲酵母菌病患者陰道微生態和菌種藥物敏感性分析. 現代婦產科進展， 2020， 29（10）： 748-751.

[8] 馬曉彤， 李煥榮， 王慧慧， 等. 陰道微生態理論應用于外陰陰道假絲酵母菌病的研究進展. 中華婦產科雜志， 2020， 55（4）： 284-286.

[9] Waikhom S D， Afeke I， Kwawu G S， et al. Prevalence of vulvovaginal candidiasis among pregnant women in the Ho municipality， Ghana： species identification and antifungal susceptibility of Candida isolates. BMC Pregnancy Childbirth， 2020， 20（1）： 266.

[10] 黃丹， 尤共平， 張曉蕾， 等. 復發性外陰陰道假絲酵母病miR-1192與Th17細胞因子水平及臨床意義. 中華醫院感染學雜志， 2021， 31（13）： 1982-1986.

[11] 高愛莉， 代歆悅， 李華平， 等. 外陰陰道念珠菌病患者血清及分泌物氧化應激因子表達水平及意義. 中國皮膚性病學雜志， 2021， 35（5）： 486-491.

[12] 于紅艷， 王華， 高華宏， 等. 伊曲康唑聯合制霉菌素治療復發性陰道假絲酵母病療效. 中華醫院感染學雜志， 2020， 30（14）： 2119-2123.

[13] 胡紅珍， 王麗娟， 李麗萍， 等. 復發性外陰陰道假絲酵母菌病的菌種及藥物敏感度研究. 新醫學， 2016， 47（9）： 604-608.

[14] Donders G G， Grinceviciene S， Ruban K， et al. Vaginal pH and microbiota during fluconazole maintenance treatment for recurrent vulvovaginal candidosis （RVVC）. Diagn Microbiol Infect Dis， 2020， 97（2）： 115024.

[15] 韓月， 夏云， 談勇， 等. 基于夏桂成改邪養正觀探討重建RVVC患者陰道微生態的辨治思路與方法. 南京中醫藥大學學報， 2020， 36（6）： 799-800， 803.

[16] Bonfim-Mendon?a P S， Tobaldini-Valério F K， Capoci I R， et al. Different expression levels of ALS and SAP genes contribute to recurrent vulvovaginal candidiasis by Candida albicans. Future Microbiol， 2021， 16： 211-219.

[17] Alvendal C， Mohanty S， Bohm-Starke N， et al. Anti-biofilm activity of chlorhexidine digluconate against Candida albicans vaginal isolates. PLoS One， 2020， 15（9）： e0238428.

（收稿日期：2022-02-28）

（本文編輯：林燕薇）