沉默IL-37表達對骨肉瘤細胞的影響及其作用機制研究

陳海堡?宋毅昌?彭磊?曾統?張迪?靳松

【摘要】目的 探討IL-37對骨肉瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其作用機制。方法 定量逆轉錄PCR（RT-qPCR）檢測人正常成骨細胞（hFOB1.19）和骨肉瘤細胞（U2OS、MG63、Saos-2）中IL-37 mRNA的表達情況;設計沉默IL-37的小干擾RNA（siRNA）序列轉染骨肉瘤細胞系，將轉染干擾序列siIL-37沉默IL-37表達的細胞作為siIL-37組，轉染陰性對照序列作為陰性對照組（siNC組），檢測沉默IL-37后骨肉瘤細胞IL-37 mRNA的表達。采用CCK-8法、Transwell法檢測沉默IL-37表達對骨肉瘤細胞增殖、侵襲和遷移的影響;流式細胞術檢測沉默IL-37表達對骨肉瘤細胞凋亡的影響;蛋白免疫印跡法檢測沉默IL-37表達對骨肉瘤細胞中B淋巴細胞瘤（BCL） 關聯X蛋白（BAX）/

BCL-2和Wnt/β-catenin信號通路中關鍵蛋白表達的影響。結果 IL-37 mRNA在U2OS、MG63和Saos-2細胞中均高于其在hFOB1.19細胞中的表達（P均< 0.05）。siIL-37組中的IL-37 mRNA相對表達量均低于siNC組（P均< 0.05）。與siNC組比較，siIL-37組的細胞增殖比例下降，細胞凋亡率升高，遷移和侵襲細胞數量增多，BAX表達上調而BCL-2表達下調，Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵蛋白c-Myc、β-catenin、轉錄增強因子1、細胞周期蛋白D1和基質金屬蛋白酶-7表達均下調（P均< 0.05）。結論 IL-37在骨肉瘤細胞中表達升高，沉默IL-37表達可促進骨肉瘤細胞凋亡，并抑制其增殖、遷移和侵襲。IL-37可能通過BAX/BCL-2和Wnt/β-catenin信號通路調控骨肉瘤的發生發展。

【關鍵詞】骨肉瘤;白介素-37;B淋巴細胞瘤關聯X蛋白/B淋巴細胞瘤-2;Wnt/β-catenin信號通路

Effect and mechanism of IL-37 silencing on osteosarcoma cells Chen Haibao， Song Yichang， Peng Lei， Zeng Tong， Zhang Di， Jin Song. Department of Spinal Surgery， the Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Shenzhen 518033， China

Corresponding author， Jin Song， E-mail： jingso@163.com

【Abstract】Objective To investigate the effect of IL-37 on the proliferation， apoptosis， migration and invasion of osteosarcoma cells and its mechanism. Methods The expression of IL-37 in human normal osteoblasts （hFOB1.19） and osteosarcoma cell lines （U2OS， MG63， Saos-2） was detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （RT-qPCR）. The siRNA sequence silencing IL-37 was designed and transfected into the osteosarcoma cell lines. Cells transfected with siRNA sequence silencing IL-37 were assigned into the siIL-37 group， and those transfected with negative controls were allocated into the siNC group. The expression of IL-37 mRNA in osteosarcoma cells after IL-37 silencing was detected. The effect of IL-37 silencing on the proliferation， invasion and migration of osteosarcoma cells was evaluated by CCK-8 and Transwell chamber test. The effect of IL-37 silencing on the apoptosis of osteosarcoma cell lines was detected by flow cytometry. The expression levels of key proteins in the BAX/BCL-2 and Wnt/β-catenin signaling pathway of osteosarcoma cell lines before and after silencing IL-37 were determined western blot. Results The expression levels of IL-37 mRNA in osteosarcoma cell lines U2OS， MG63 and Saos-2 were significantly higher than that in normal osteoblast cell line （all P < 0.05）. For osteosarcoma cell lines U2OS， MG63 and Saos-2， the relative expression levels of IL-37 mRNA in the siIL-37 group were significantly lower than those in the siNC group （all P < 0.05）. Compared with the siNC group， cell proliferation rate was declined， cell apoptosis rate was increased， the quantity of cell migration and invasion was elevated， BAX expression was up-regulated， BCL-2 expression was down-regulated， and the expression levels of c-Myc， β-catenin， TEF1， Cyclin D1 and MMP-7 in the Wnt/β-catenin signal pathway were down-regulated in the siIL-37 group （all P < 0.05）. Conclusions The expression level of IL-37 is up-regulated in osteosarcoma cell lines. Silencing IL-37 can promote the apoptosis of osteosarcoma cells and inhibit the proliferation， migration and invasion. IL-37 plays an important carcinogenic role in the occurrence and development of osteosarcoma possibly through the BAX/BCL-2 and Wnt/ β-catenin signaling pathways.7F944AAC-4598-448F-B03E-000D20C17999

【Key words】Osteosarcoma; IL-37; BAX/BCL-2; Wnt/β-catenin signaling pathway

骨肉瘤是世界上最常見的兒童骨惡性腫瘤，也是兒童惡性腫瘤死亡的第八大原因。隨著治療理念及技術的改進，骨肉瘤患者的5年總體生存率明顯提高，但治愈率未有提高，而且出現轉移或復發患者的預后較差[1]。分子靶向治療是骨肉瘤的治療新策略，識別新的靶點和驅動骨肉瘤發病的潛在分子機制至關重要。IL-37是近年被發現的IL-1家族成員，具有天然的炎癥和免疫抑制作用，與調控腫瘤的增殖和轉移相關[2]。然而IL-37在骨肉瘤中的生物學功能尚未被闡明。B淋巴細胞瘤（BCL）家族蛋白是細胞凋亡的重要調控因子，其通過調節線粒體通透性來調節凋亡激活物如細胞色素C的釋放來影響細胞的狀態，BCL-2家族包括促凋亡蛋白BCL關聯X蛋白（BAX）和抗凋亡蛋白BCL-2[3]。Wnt/β-catenin通路是骨肉瘤中常見的信號通路，在調節腫瘤細胞增殖、轉移等方面發揮重要作用[4]。在正常的體細胞中，β-catenin僅作為一種細胞骨架蛋白在胞膜處與鈣黏蛋白形成復合體，在維持同型細胞的黏附、防止細胞的移動中發揮作用。當細胞外Wnt信號分子與細胞膜上特異性受體Frizzled蛋白結合后，激活胞內蛋白Dvl。Dvl通過抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β）等蛋白形成的β-catenin降解復合物的降解活性，穩定細胞質中游離狀態的β-catenin蛋白。胞漿中穩定積累的β-catenin進入細胞核后結合淋巴增強因子/ T細胞因子（LEF/TCF）轉錄因子家族，啟動下游靶基因如轉錄增強因子1（TEF1）、c-Myc、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和基質金屬蛋白酶-7（MMP-7）等的轉錄。為此，本研究中通過定量逆轉錄PCR（RT-qPCR）檢測IL-37在骨肉瘤細胞中的表達，并且進一步探討IL-37對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及與Wnt/β-catenin信號通路關系，為骨肉瘤的靶向治療提供新的證據，現報道如下。

材料與方法

一、主要材料

本實驗所用的人類正常成骨細胞系（hFOB1.19）和骨肉瘤細胞系（U2OS、MG63、Saos-2）均購于中國科學院;10%胎牛血清（FBS）購自美國HyClone公司;高糖型DMEM培養基、谷氨酰胺購自美國Gibco公司;胰酶、0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）、青霉素-鏈霉素混合液（雙抗）、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、細胞增殖及毒性檢測試劑盒（CCK-8法）購自美國Sigma公司;逆轉錄（RT）試劑盒及qPCR試劑盒、Trizol RNA抽提試劑、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司;Transwell孔板購自美國Corning公司;IL-37（ab93959，兔抗人）購自美國Abcam公司;β-actin抗體（AA128，鼠抗人）、BAX抗體﹑

BCL-2抗體﹑TEF1抗體﹑c-Myc抗體、Cyclin D1抗體﹑MMP-7抗體購自美國CST公司，辣根過氧化物酶標記二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司。

二、方 法

1. 細胞培養與小干擾RNA（siRNA）瞬時轉染

hFOB1.19細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，骨肉瘤細胞系（U2OS、MG63和Saos-2）使用含有10%FBS的DMEM培養基，在37 ℃、5% CO2、95%濕度下培養，24 h后更換新鮮的培養基，在顯微鏡下觀察細胞的密度分布及其生長狀態，以后每3 d換液1次。將生長狀態良好的骨肉瘤細胞按照上述步驟消化后接種在需要進行相應實驗的培養孔板上，待細胞生長匯合度為80%，棄除培養基加入適量的無血清培養基。干擾序列siIL-37（5′-ACAAAACUCCCCUUUAGAG AC-3′）及轉染無意義的陰性對照序列（5′-CUCUAA

AGGGGAGUUUUGUCU-3′）由上海吉瑪基因股份有限公司設計合成。嚴格按照Lipofectamine? RNAiMAX轉染試劑盒說明書制備轉染混合物。將上述的siRNA轉染混合物加入相應的細胞培養板孔，置于37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養箱中培養3 d，用RT-qPCR檢測轉染效率并進行下一步實驗。其中轉染干擾序列siIL-37沉默IL-37表達的細胞作為siIL-37組，轉染陰性對照序列作為陰性對照組（siNC組）。所有實驗重復3次。

2. RT-qPCR

根據TRIzol試劑盒使用說明書提取細胞中的總RNA。取100 ng的總RNA為模板，通過RT試劑盒合成模板DNA（cDNA），取cDNA和引物，嚴格按照TaKaRa公司SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書配制PCR反應液。RT-qPCR反應參數為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環。反應結束后，PCR擴增儀自動分析并得出Ct值，采用2-ΔΔCt法計算IL-37 mRNA相對表達量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，具體序列見表1。

3. CCK-8 法檢測細胞增殖

選擇生長狀態良好的hFOB1.19細胞常規消化后按1000個/孔的密度接種于96孔板，均勻鋪板置于37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養箱中培養過夜。按上述的步驟轉染siRNA干擾序列，沉默IL-37的表達，設置陰性對照的siNC組。轉染培養72 h后棄除培養基，加入含有10 ?L CCK-8試劑的完全培養基110 ?L，置于37 ℃、5%CO2、95%濕度的培養箱中孵育2 h。在全自動酶標儀上測定每孔在450 nm處的吸光度（A）值并分析結果。細胞增殖比例=（As-Ab） / （Ac-Ab），其中As為實驗孔A值（含培養基、CCK-8 溶液、分別予siIL-37或siNC轉染細胞），Ac為對照孔A值（含培養基、CCK-8溶液，未使用siRNA處理的細胞），Ab為空白孔A值（含培養基、CCK-8 溶液，不含細胞）。7F944AAC-4598-448F-B03E-000D20C17999

4. 細胞遷移和侵襲實驗

按照Transwell染色試劑盒說明書用無血清培養基將其稀釋至250 ?g/mL的工作濃度，取100 ?L

稀釋的基質膠加入Transwell上層小室，置于37 ℃的培養箱中孵育4 h。選擇瞬時轉染48 h后的骨肉瘤細胞，常規消化后用含1% FBS培養基重懸細胞計數，調整細胞密度至約1.25×105/mL。24孔板中每孔加入含20% FBS培養基作為下層小室，取200 ?L細胞懸液加入Transwell遷移和侵襲上層小室，小心地將上層小室置入24孔板中，置于

37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養箱中孵育24 h。取出遷移及侵襲小室，用4%多聚甲醛穿過小室的細胞固定30 min，再用結晶紫將其染色15 min。然后用棉簽輕柔拭去小室里面未遷移穿膜的細胞。靜置干燥后在顯微鏡下通過計數穿膜細胞的數量反映細胞侵襲能力，用Image J計數并進行統計分析。

5. 流式細胞術檢測細胞凋亡

轉染48 h后的骨肉瘤細胞用不含EDTA的胰酶消化，上清培養液終止消化，1000轉/分離心

5 min，收集細胞，使用500 μL連接緩沖液重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，避光，室溫孵育15 min。孵育染色后，然后往每管加入400 ?L連接緩沖液混勻，1 h內上機檢測。所得數據用相關配套軟件分析并繪制散點圖。

6. 蛋白免疫印跡法檢測相關蛋白表達

采用蛋白免疫印跡法檢測siIL-37組和siNC組細胞中的BAX、BCL-2以及Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-7、TEF1的表達，檢測步驟參照前期研究[5]。

三、統計學處理

采用SPSS 20.0處理數據。數據均經正態性檢驗符合正態分布，計量資料以? 表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、正常成骨細胞系和骨肉瘤細胞系細胞中IL-37 mRNA的表達情況比較

RT-qPCR結果顯示，IL-37 mRNA在3種骨肉瘤細胞系（U2OS、MG63、Saos-2細胞）中的相對表達量均高于其在正常成骨細胞系hFOB1.19細胞中的相對表達量（F = 13.332，P < 0.01;Dunnett-t檢驗P均< 0.05），見圖1。

二、沉默siIL-37表達對3種骨肉瘤細胞中IL-37 mRNA表達的影響

3種骨肉瘤細胞在siIL-37組中的IL-37 mRNA相對表達量均低于其在siNC組中的相對表達量

（P均< 0.05），其中IL-37 mRNA在U2OS（t = 138.276，P < 0.01）和MG63（t = 151.863，P < 0.001）細胞中的表達抑制率均> 80%，故后續實驗選擇這2種細胞作進一步的研究分析，見圖2。

三、沉默IL-37表達對骨肉瘤細胞增殖的影響

CCK-8法結果顯示，U2OS細胞和MG63細胞中siIL-37組的細胞增殖比例均低于siNC組（t分別為78.521和68.672，P均< 0.001），見圖3。

四、沉默IL-37表達對骨肉瘤細胞凋亡的影響

流式細胞術結果顯示，U2OS細胞和MG63細胞中siIL-37組的細胞凋亡率均高于siNC組（t分別為4.257和22.532，P均< 0.05），見圖4。

五、沉默IL-37表達對骨肉瘤細胞遷移和侵襲的影響

Transwell實驗結果顯示，無論是在U2OS細胞中還是在MG63細胞中siIL-37組的遷移細胞數量（t分別為33.213和24.427，P均< 0.001）和侵襲細胞數量（t分別為15.856和45.123，P均< 0.01）均多于siNC組，見圖5。

六、沉默IL-37表達對凋亡和Wnt/β-catenin信號通路各蛋白表達的影響

蛋白免疫印跡法結果顯示，與siNC組比較，無論是在U2OS細胞中還是在MG63細胞中siIL-37組BAX蛋白表達均上調（t分別為6.371和4.968，P均< 0.05），而BCL-2蛋白表達均下調（t分別為14.576和8.946，P均< 0.01），且TEF1（t分別為9.758和7.968，P均< 0.01）、c-Myc（t分別為14.652和10.572，P均< 0.01）、Cyclin D1（t分別為19.629和17.384，P均< 0.001）和MMP-7（t分別為21.728和16.368，P均< 0.001）蛋白表達均下調。進一步檢測β-catenin蛋白顯示，siIL-37組U2OS和MG63細胞中的β-catenin蛋白相對表達量均低于siNC組（t分別為6.873和8.173，P均< 0.01），見圖6。

討論

骨肉瘤具有病死率高、治愈率低的特點。現階段，新輔助化學治療、切除腫瘤和保肢重建手術是治療骨肉瘤的主要策略。經過有效治療，高級別骨肉瘤患者的5年生存率可達60%～70%，因此有必要尋找更精確的診斷生物標志物及闡明骨肉瘤發生和轉移的分子機制，為骨肉瘤的治療提供潛在治療靶點[6]。本研究驗證了IL-37在人骨肉瘤細胞系有高表達。沉默IL-37表達可抑制細胞增殖并同時促進細胞凋亡，證實IL-37與骨肉瘤的發生有關。本研究還顯示，沉默IL-37表達可抑制骨肉瘤細胞遷移和侵襲，這也表明IL-37可能與骨肉瘤的侵襲性生物行為有關。骨肉瘤的惡性生物學行為涉及復雜的分子機制和不同信號通路的激活。BCL-2家族蛋白是細胞凋亡的重要調控因子，包括促凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白BCL-2。本研究蛋白免疫印跡結果顯示，沉默IL-37表達上調骨肉瘤細胞中BAX表達，而下調BCL-2的表達，研究結果表明IL-37可能通過BAX/BCL-2調控骨肉瘤增殖凋亡的惡性生物學行為。前期研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在人類骨肉瘤的發病和發展中起著關鍵作用，該途徑調節細胞中β-catenin表達水平，促進腫瘤血管生成和逃避免疫監測，對骨肉瘤侵襲性進展起關鍵作用[7]。Wnt/β-catenin通路中的下游靶標TEF1、c-Myc、Cyclin D1和MMP-7在調控腫瘤增殖、凋亡、侵襲和轉移等惡性生物學行為中發揮至關重要的作用[8-10]。本研究7F944AAC-4598-448F-B03E-000D20C17999

中，沉默IL-37表達后Wnt/β-catenin通路的關鍵蛋白β-catenin及其下游靶標（TEF1、c-Myc、Cyclin D1和MMP-7）均相應下調。c-Myc是人類常見的活化原癌基因之一，參與多種惡性腫瘤的發生發展[11]。作為轉錄因子，早期研究發現c-Myc轉錄靶標參與了許多生物過程，如代謝、細胞生長、細胞周期調節和細胞凋亡。Cyclin D1充當細胞周期進程的中央調節器，該蛋白的異常表達促使細胞的周期發生改變是腫瘤發生的重要因素[12]。MMP家族組成一系列轉錄因子，它們能夠調節腫瘤的微環境，主要是通過細胞外基質的降解來實現的，外基質的降解為細胞的侵襲和轉移創造了條件[13]。MMP-7的表達和激活在幾乎所有類型的惡性腫瘤中都存在，尤其與腫瘤轉移有關[14]。研究結果表明，IL-37可能通過BAX/BCL-2和Wnt/β-catenin信號通路調控骨肉瘤發生發展，因此有望成為骨肉瘤臨床早期診療的腫瘤標志物和治療靶標。

綜上所述，IL-37在骨肉瘤細胞中上調，沉默IL-37可以抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與BAX/BCL-2表達和調控Wnt/β-catenin信號通路有關。研究結果為骨肉瘤發生機制的深入研究奠定了基礎，對骨肉瘤的預防及治療具有一定意義，但本研究僅在體外評估了IL-37的生物學功能，下一步將用動物實驗進行體內驗證。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2022-02-15）

（本文編輯：林燕薇）7F944AAC-4598-448F-B03E-000D20C17999