食源性沙門氏菌血清分型及分子分型分析

周建松 簡潔 蔣家俊 劉小華 李婉宜

（1.貴陽市疾病預防控制中心檢驗科，貴州 貴陽 550000；2.四川大學華西基礎醫學與法醫學院病原生物學系，四川 成都 610000）

沙門氏菌是一種常見的革蘭陰性桿菌致病菌，截止至2007 年，全球已發現并確認超過2579 種沙門氏菌血清型[1]。根據致病沙門氏菌種類的不同，可引起傷寒、敗血癥和腸胃炎的不同癥狀[2]。據報道，全球每年由沙門氏菌引起的感染人數約9380 萬，感染者死亡的數量更是達到了15.5 萬，美國CDC2013 年的調查顯示，在引起食物中毒的致病菌中，沙門氏菌的數量占據首位[2-3]。在中國，食品安全的問題也很嚴峻，據資料顯示，細菌性食物中毒中約有70%～80%由沙門氏菌引起[4]。廣州、浙江、貴州多地均報道過由沙門氏菌引起的食物中毒事件[5-7]。

病原菌分型是疾病監測及流行病學研究的基礎，也是食物中毒事件污染源溯源的重要手段，目前對于沙門氏菌的分型主要分為血清分型和分子分型[8]。傳統血清分型具有操作難度低，高效快速等優點，但目前已知沙門氏菌血清型種類多達2500種以上，且存在不典型沙門氏菌與較多干擾菌，因此，單純的血清分型已不能滿足食源性疾病的診斷及對致病菌溯源。脈沖場凝膠電泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）技術是利用DNA 分子處于電場作用下，在凝膠中遷移率不同而達到分離DNA分子的目的，進而通過比較條帶相似性確定其親緣關系，其具有可重復性好，分辨力高的特點，是目前分子分型的“金標準”，現已被廣泛用于多種病原體爆發流行的溯源分析中[9]。

發生食源性事故時，應盡快結合血清與PFGE分型技術對沙門菌進行型別鑒定，確定并追蹤其來源，避免事件進一步惡化[10]。本研究擬通過對貴陽市2015 年至2020 年33 株食源性沙門氏菌進行血清分型和PFGE 分子分型，評價不同血清型別的沙門氏菌親緣性，并為貴陽市沙門氏菌感染的防控提供實驗數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

33 株沙門菌分離自貴陽市2015 年至2020 年的病例監測、食物中毒和食品監測。PFGE 標準菌株H9812 來自貴州省疾病預防控制中心。

1.1.2 實驗試劑及耗材

緩沖蛋白胨水、營養瓊脂等（北京路橋），沙門氏菌顯色培養基（法國科瑪嘉），SKG 瓊脂糖精（美國LONZA），1M Tris-HCL 緩沖液、0.5M EDTA、5×TBE（北京Solarbio），限制性內切酶Xba1、10×Buff 緩沖液（美國BioLabs），蛋白酶K（德國Merck），PFGE 用梳子、模具（美國Bio-Rad），Gelred染液（美國Biotium），恒溫恒濕培養箱、水浴恒溫振蕩器（上海躍進醫療器械有限公司），脈沖凝膠電泳儀、成像儀（美國Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 菌株復核鑒定

參照《GB 4789.4-2016 沙門氏菌檢驗》進行。將貴陽市疾控中心保存的目標菌株的磁珠接種于緩沖蛋白胨水（Buffered peptone water，BPW），36℃培養16 h 后接種于沙門氏菌顯色培養基中，繼續36℃培養18 h，通過其產生的顏色進行初步篩選，挑取紫紅色可疑單獨菌落接種于三糖鐵瓊脂進行二次判斷。

若生長結果有異，可接種營養瓊脂（Nutrient agar，NA）36℃培養18 h 后，挑取單個菌落配置菌懸液進行Vitek-2 生化鑒定。

1.2.2 血清型分型

將目標菌株接種于NA，36℃培養19 h，取一個干凈無劃痕的培養皿，將診斷血清滴一滴于其上并挑取單個菌落與之混勻，在燈光下觀察其是否凝集。

凝集順序為：先凝O 血清，根據其凝集的O 血清的不同，參照對比表選擇H 血清，進而確定其血清型。

1.2.3 PFGE 分子分型

該實驗步驟以標準菌株H9812 為對照。挑取目標菌株單個菌落接種于NA 36℃培養18 h。稱取適量Seakem Glod（SKG）瓊脂糖，配置適量1% SKG瓊脂糖，熔化后放入55℃的恒溫箱備用。使用細胞懸浮液（Cell Suspension Buffer，CSB）制備麥氏比濁濃度為4 的菌懸液，取400 μL 菌懸液加入無菌1.5 mL 離心管中，加入25 μL 蛋白酶K，使用制膠模具制成膠塊。在50 mL 離心管中加入5 mL 細胞裂解液（Cell lysis buffer，CLB）與25 μL 蛋白酶K，放入膠塊后置于55℃轉速150 rpm 的震蕩水浴鍋裂解2 h。裂解結束后倒出液體，

使用超純水及TE 緩沖液（Tris :EDTA buffer，TE）進行清洗。清洗完成后，加入常溫10 mLTE 放入4℃冰箱保存備用。使用XbaⅠ 酶37℃酶切2.5 h，電泳19 h 后，用GelRed 染色，于凝膠成像儀觀察結果。

1.3 統計學分析

所有數據通過Excel軟件和SPSS17.0統計軟件進行分析。運用 BioNumerisc 7.6 軟件進行處理和聚類分析，相似度系數設置為Dice，容許度設置1.5%，采用非加權平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGM）行聚類分析并且繪制聚類圖。

2 結果

2.1 血清分型結果

在33 株食源性沙門氏菌中，鼠傷寒沙門氏菌有15 株，占比46%，德爾卑沙門氏菌有7 株，占比21%，嬰兒沙門氏菌有5 株，占比15%，腸炎沙門氏菌4 株，占比12%，肯塔基沙門氏菌2 株，占比6%。

本次實驗菌株數量占比最高的為鼠傷寒沙門氏菌（15 株）與德爾卑沙門氏菌（7 株），屬于本次實驗的優勢菌株。

2.2 PFGE 分子分型結果

2.2.1 食源性沙門氏菌PFGE 分子分型結果

33 株食源性沙門氏菌經過PFGE 分子分型，僅有29 株條帶可經BioNumerics 軟件進行分析，剩余菌株共得出24 種條帶類型，對其用P1-P24 編號。

通過聚類分析菌株總相似度為56.4%，其中完全相同的有4 組，分別是P5 條帶（11、12，血清型均為嬰兒沙門氏菌）、P15 條帶（8、9、10，血清型均為鼠傷寒沙門氏菌）、P20 條帶（1、4，血清型均為德爾卑沙門氏菌）以及P24 條帶（13、16，血清型均為腸炎沙門氏菌），如圖1 所示。

圖1 29 株沙門氏菌聚類分析

優勢帶型P15 包含3 株菌，P5、P20 以及P24均包含2 株菌，其余20 種帶型各包含1 株菌（若相似度高達100%，則視為同一PFGE 型，即PFGE圖譜完全一致，同一帶型在圖譜中呈現相對較多的菌株帶型稱為優勢帶型）。在相似度100%的條帶中，P5 帶型的11 與12 號均為2017 年檢出，且血清型結果均為嬰兒沙門氏菌，推測其來源為同一株菌，同理P15 帶型，P20 帶型也均來源于同一株菌。P24帶型的腸炎沙門氏菌，一株于2015 年（16）檢出，一株于2016 年（13）檢出。推測造成2015 年食源性事故的污染源并未完全清除，傳播途徑未切斷，導致其在2016 年再次造成危害。

2.2.2 優勢血清型鼠傷寒沙門氏菌PFGE 聚類結果分析

15 株鼠傷寒沙門氏菌分型分為10 種帶型（其中3 株菌所出條帶顏色對比暗淡，難以上機分析，原因可能是此次使用的Xba 1 酶不適用或者是所用蛋白酶K 存放時間過長，效能減退），其中優勢帶型P15 占25%（3/12），剩余9 種帶型占75%（9/12）。

2.2.3 優勢血清型德爾卑沙門氏菌PFGE 聚類結果分析

7 株德爾卑沙門氏菌分型為5 種帶型（其中1株菌所出條帶顏色暗淡，難以上機分析，原因可能與無法分析的3 株鼠傷寒沙門氏菌一致），其中優勢帶型P20占33.3%（2/6），其余帶型占66.7%（4/6）。

3 討論

本次實驗鼠傷寒沙門氏菌與德爾卑沙門氏菌為優勢菌株，與江西優勢菌株為鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、德爾卑沙門氏菌的結論基本相同[11]，與聊城市的結果存在一定差別[12]，表明不同來源的菌株血清型別存在一定差異。

通過PFGE 技術對2015 年至2020 年貴陽市29株食源性沙門氏菌進行分子分型，所獲條帶經BioNumerics 軟件進行處理，根據條帶數量以及位置的不同將29 株沙門氏菌分出24 種帶型。聚類顯示條帶總相似度為56.4%～100%，結果呈現多態性。優勢血清型存在明顯優勢帶型，12 株鼠傷寒沙門氏菌有10 種帶型，優勢帶型為P15 型；6 株德爾卑沙門氏菌有5 種帶型，優勢帶型為P20。相同帶型中，腸炎沙門氏菌（13，16）分別為2015 年與2016 年檢出，提示貴陽市可能存在對部分沙門氏菌傳播源清除不徹底，傳播途徑并未完全切斷的問題，應加強對所有已發生沙門氏菌傳播源進行實時監控，做好防控措施。

此外，因沙門氏菌引起的感染多以散發形式報告的，甚至很多情況下未對該致病菌進行檢測，但通過本研究發現部分散發病例有一定的聚集傾向，因此及時做好食物中毒患者、醫院腹瀉患者和食品監測中的病原菌分離鑒定工作并及時開展 PFGE分型有利于及時監測發現并控制潛在食源性疾病暴發。