L-半胱氨酸快速綠色提取稻米中汞形態的前處理方法研究

陳 曦， 周明慧， 王松雪， 張潔瓊， 田 巍， 伍燕湘

(國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037)

水稻是世界半數人口的主要糧食作物，我國有65%的人口以大米為主食[1]，其安全性對我國居民的健康有重要影響。由于特殊的生長環境，水稻比其他作物更易富集重金屬，并可將毒性較弱的元素形態轉化為毒性更強的形態[2, 3]。稻米是人體甲基汞暴露的重要途徑，特別是汞污染礦區居民甲基汞暴露的主要途徑[4]。甲基汞作為毒性最強的汞化合物，主要具有神經毒性，并具有很高的生物蓄積性，進入人體后可穿越血腦屏障，對中樞神經系統產生永久性損傷[5, 6]。因此，對稻米中的汞形態進行精準檢測尤為重要。

在元素形態分析中，樣品提取是最重要的步驟。GB 5009.17—2014中規定食品中甲基汞的提取劑為5 mol/L鹽酸，樣品浸泡過夜后使用超聲水浴提取1 h，期間需振搖數次，且在上機檢測前需調節提取液pH，此過程溫度控制不當極易造成低溫汞化合物的損失[7]。對于甲基汞的提取，目前提取液基本依賴酸或堿性提取介質，提取方式大多為超聲水浴、水蒸氣蒸餾或固相微萃取等[8]，提取過程同樣復雜耗時；對比酸提取，堿性介質提取所需時間更長，并且在甲基汞含量較低時存在復雜的基體效應[9]。由此可見，常規汞形態檢測方法的前處理過程耗時長，操作繁瑣，實驗中消耗大量的強腐蝕性酸堿，無法準確定量無機汞，難以適應大批樣品高通量綠色快速檢測的需求。故在檢測分析中，開發快速簡便綠色的汞形態提取方法是當前行業急需解決的科研難題。

重金屬化合物在稻米樣品中與蛋白質牢固結合，采用含有相關配體或功能基團的酸性試劑能夠提取某些元素[10]。基于此，本研究選擇對人體和環境無危害的L-半胱氨酸作為提取劑，利用高效率的超聲破碎方法提取稻米中的汞形態，樣品無需浸泡過夜，15 min即可完成提取，提取完成后可直接上機檢測。本研究通過對L-半胱氨酸濃度及超聲破碎提取參數進行優化，建立了稻米中汞形態的快速綠色提取方法。所開發方法無需強腐蝕性酸堿試劑，常溫完成提取過程，后續無需調節pH和定容，明顯降低汞化合物的揮發風險，全面提高稻米中汞形態的檢測效率和準確性，同時降低檢測成本，為目前糧食行業精準檢測谷物中汞形態提供一種強有力的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

汞元素天然污染糙米和大米樣品由國家糧食和物資儲備局科學研究院實地扦取提供。

L-半胱氨酸(98.5%)；GBW08617汞單元素溶液標準物質、GBW(E)083364甲基汞溶液標準物質；鹽酸(優級純)；硼氫化鉀、氫氧化鉀和過硫酸鉀(優級純)。

1.2 儀器與設備

950E超聲波細胞破碎機，BAS-100A型液相色譜-原子熒光聯用儀(配有汞空心陰極燈)，ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6×150 mm, 5 μm)，Milli-Q超純水處理系統，3-30K高速離心機，Pulverisette 14粉碎機。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理方法

稻米樣品經粉碎機研磨至過60目(0.25 mm)樣品篩，先在離心管中加入2.5 mL質量分數為1%L-半胱氨酸溶液，稱取0.500 g均勻樣品后，再加入2.5 mL 1%L-半胱氨酸溶液，混勻；設置超聲破碎功率為150 W，超聲時間15 min，提取完成后8 000 r/min離心5 min，吸取上清液，過0.22 μm濾膜后使用液相色譜-原子熒光光譜聯用方法(LC-AFS)進行檢測。

1.3.2 對比方法

稱量均勻稻米樣品0.500 g，按照GB 5009.17—2014標準方法第二篇規定的試樣提取方法進行前處理，使用LC-AFS測定其中的無機汞和甲基汞。

1.3.3 儀器條件

液相色譜條件：流動相：5%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.1%L-半胱氨酸；流速：1 mL/min；進樣量：100 μL。

原子熒光光譜條件：負高壓：280 V；汞燈電流：30 mA；原子化器溫度：200 ℃；載氣流速：400 mL/min；屏蔽氣流速：800 mL/min；載流：5%HCl；還原劑：0.5%KOH+0.2%KBH4；氧化劑：0.2%K2S2O8。

2 結果與討論

2.1 提取劑濃度優化

GB 5009.17—2014中使用鹽酸作為提取劑，為兼顧C18色譜柱耐受的pH環境(pH為2～7)，樣品提取液在上機檢測前需調節pH，鹽酸提取劑的濃度為5 mol/L(質量分數約為40%)，酸度極大，在調節pH時不僅需耗費較多堿液，還會增加待測樣品被污染的風險；若調節不當使得溶液偏酸，如調節后的pH剛好處于色譜柱耐受條件的下限，約為2.0，則導致無機汞和甲基汞色譜峰分離度極差，無法定量，見圖1；同時在調節pH過程中應注意控制溫度，緩慢逐滴加入堿液，或將提取液置于冰水浴中操作，因為大量酸堿中和會產生更多熱量，熱量來不及擴散會使溶液溫度很快升高導致低溫汞形態損失，使得無機汞和甲基汞的加和數據低于總汞測定結果，如圖2所示。

圖1 pH調節偏酸情況下無機汞和甲基汞色譜峰的分離度(pH≈2.0)

圖2 pH調節溫度控制不當導致無機汞損失(堿液加入速度過快)

L-半胱氨酸為一種含巰基、氨基和羧基的陽離子多基配體，水溶液呈酸性，對汞元素有較強的螯合能力[11, 12]，具有生物相容性，其安全性已通過美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration, FDA)的安全認證[13]。故本研究選擇L-半胱氨酸作為稻米中汞形態的提取劑，前期測試結果顯示，質量分數3%L-半胱氨酸的pH約為2.0，結合C18色譜柱適宜的pH范圍2～7，設置提取劑質量分數分別為0.1%、0.3%、0.5%、1%、1.5%、2%和3%，固定超聲破碎功率為200 W，超聲時間為15 min，以汞天然污染糙米樣品(YN-378)作為測試樣品，總汞定值為(0.018±0.001 5)mg/kg，提取劑濃度優化結果見圖3。

圖3 L-半胱氨酸質量分數、超聲功率、超聲時間對不同汞形態提取結果的影響(n=3)

提取劑質量分數為0.1%～0.5%，糙米樣品中無機汞和甲基汞的提取結果均隨著L-半胱氨酸濃度的增加而呈上升趨勢；提取劑質量分數為1%～3%，2種汞形態的提取結果保持穩定，汞形態加和結果符合總汞定值范圍，故選擇1%L-半胱氨酸作為稻米中汞形態的提取劑。實驗結果說明稻米中汞元素的提取基本依賴巰基配體和低酸環境，初步證實谷物中汞的主要存在形態為硫化物結合態。

2.2 超聲破碎參數優化

GB 5009.17—2014中規定食品中甲基汞的提取方式為超聲水浴法，常用儀器為超聲波清洗器。本研究在前期摸索中發現，該儀器受自身功率所限，提取效率低，導致提取時間長，并需在過程中振搖數次，提取結果受人為因素影響大。另外，超聲波清洗器需要液體作為超聲波傳導介質，在運行過程中產生的噪聲較大，長時間操作影響實驗人員健康。另一種具有超聲波提取功能的設備為超聲波細胞破碎儀，該儀器功率大，能夠有效減少提取時間，且配備的隔音箱可以降低工作過程中發出的噪聲。本研究試圖使用超聲波細胞破碎儀提取稻米中的汞形態，通過優化超聲破碎方法參數，確定提取條件。

以YN-378作為測試樣品，根據提取劑濃度優化結果，固定提取劑為1%L-半胱氨酸溶液，超聲時間為15 min，參考儀器工程師推薦條件，設置超聲破碎功率分別為80、100、120、150、180、200 W，超聲功率優化結果如圖4所示。

超聲功率為120～200 W時，YN-378糙米樣品中無機汞和甲基汞的提取結果不隨超聲功率的變化而發生明顯變化，汞形態加和結果與總汞定值范圍基本一致，故選擇150 W作為超聲功率提取條件。因此，固定提取劑為1%L-半胱氨酸溶液，超聲破碎功率為150 W，設置超聲時間為3、5、10、15、20、30 min，摸索超聲時間對不同汞形態提取結果的影響。

從圖5可以觀察出，隨著超聲時間的延長，不同汞形態的提取結果逐漸增加，至10 min時趨于穩定，2種汞形態加和結果接近總汞定值中值。基于此，超聲提取時間應設定為15 min。

2.3 方法比對

以實地扦取的汞天然污染糙米樣品YN-378、NM-005及大米樣品LD-045作為測試樣品，將本方法與GB 5009.17—2014進行比對，驗證本方法測定不同稻米樣品中汞形態的準確度。由表1可知，1%L-半胱氨酸搭配超聲破碎作為前處理方式對稻米樣品中甲基汞的提取結果與GB 5009.17—2014方法基本一致，經檢驗，2種方法對甲基汞的提取結果無顯著性差異(P>0.05)。但本方法對于無機汞的檢測結果明顯高于國標方法，汞形態加和結果也與總汞檢測數據一致，而使用GB 5009.17—2014檢測的汞形態加和普遍低于總汞定值范圍。由此證實借助超聲破碎提取方式，1%L-半胱氨酸可準確提取稻米樣品中的不同汞形態。

表1 本方法測定稻米樣品中汞形態的準確度/mg/kg

2.4 汞形態間轉化考察

采用加標回收實驗考察本方法提取稻米樣品汞形態過程中無機汞和甲基汞是否發生形態間轉化，加標水平均設在50%樣品汞形態含量左右，結果見表2。本方法對于稻米樣品中無機汞的加標回收率為97.2%～104.2%，甲基汞的加標回收率為97.4%～101.8%，數據結果證實在前處理過程中不同汞形態間沒有發生形態轉化。

表2 LC-AFS方法加標回收率

2.5 方法學評價

使用LC-AFS方法檢測稻米中無機汞和甲基汞的提取結果，以色譜峰面積為縱坐標，標準溶液中2種汞形態的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，根據色譜響應值S/N=3∶1計算檢出限，方法學參數如表3所示。本方法檢出限、標準曲線線性范圍滿足行業日常檢測所需，線性相關系數良好。

表3 本研究方法學參數

選取糙米樣品YN-378作為測試樣品，平行測定6次，無機汞和甲基汞的相對標準偏差均小于3%，證實本方法精密度良好。

3 結論

本研究通過對提取劑濃度及超聲破碎方法參數進行優化，建立了L-半胱氨酸超聲破碎提取-液相色譜-原子熒光光譜精準測定稻米樣品中無機汞和甲基汞的快速方法。樣品前處理過程無需使用酸堿和有機試劑，對環境和實驗人員友好，操作簡單，15 min完成提取，過程中不發生形態間轉化。本方法對甲基汞的檢測結果與標準方法無顯著性差異(P>0.05)，同時對無機汞的檢測準確度更高，方法檢出限和精密度滿足檢測要求，適用于大批量稻米樣品中汞形態的測定。