高壓復合pH偏移預處理對大豆蛋白糖基化復合物結構及乳化性質影響

譚孟娜, 徐晶晶, 楊雪飛, 高海鸰, 羅水忠, 李興江, 鄭 志

(合肥工業大學食品與生物工程學院；安徽省農產品精深加工重點實驗室，合肥 230601)

作為一種價格低廉，營養全面，兼具多種功能性質的植物蛋白，大豆蛋白已被廣泛應用于食品加工領域[1]。然而，大豆蛋白的分子構象主要由氫鍵及二硫鍵所穩定，形成了致密的球狀結構，導致其水溶性和分散性較差，對自身乳化性能造成限制[2,3]。糖基化反應，即羰氨反應是指糖分子的羰基與蛋白質的自由氨基經縮合、聚合后生成多種風味物質的褐變反應，反應過程中無需向體系中添加額外試劑，被認為是一種理想的蛋白改性方法[4]。Liu等[5]利用亞麻籽膠與大豆蛋白進行接枝反應，蛋白溶解性得到顯著改善。Li等[6]研究表明與未改性大豆蛋白相比，葡萄糖與大豆蛋白的美拉德反應復合物表現出了良好的分子柔韌性和乳化性能。大豆蛋白緊密的分子結構使部分糖基化反應位點被包埋在分子內部，無法與糖分子的羰基端充分接觸，因而會降低糖基化反應效率[5]。因此，在糖基化反應之前通過對大豆蛋白施加適當的處理，可以使其結構充分伸展，增加糖基化反應基團的暴露量，以增大糖基化接枝反應的發生概率[7]。

作為一種非熱加工技術，超高壓處理被廣泛應用于蛋白的修飾和改性研究中[8]。高壓處理過程中可誘導蛋白質分子之間化學作用力及各種相互作用之間的轉換[9]，使蛋白質結構展開。然而，僅超高壓處理對蛋白質的作用效果有限，因此高壓處理與其他方式的結合受到關注。pH偏移處理特別是堿性pH偏移處理可顯著改善蛋白質結構，當蛋白質溶于極端pH值溶液中時，其分子側鏈上帶有大量同種電荷，致使蛋白分子因靜電排斥作用而發生結構展開，當pH值調回中性時，隨著靜電斥力的消失蛋白質分子重新發生折疊。再次折疊后的蛋白質結構相較于初始狀態較為疏松，功能性質也隨之發生變化[10]。已有研究利用超高壓處理與堿性pH偏移處理相結合，使蛋白質發生結構展開，不溶性聚集體出現解聚行為[11]。

本研究采用超高壓協同堿性pH偏移共同處理SPI，使其結構以較大程度展開，從而增加糖基化反應位點的暴露量，以增大反應幾率，再對經預處理的SPI進行糖基化接枝改性，考察不同預處理方式對糖基化產物結構和乳化性質的影響，為改善大豆蛋白的乳化性質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(SPI)、麥芽糊精(MD)為食品級；鄰苯二甲醛(OPA)、β-巰基乙醇、四硼酸鈉、1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HHP-M1超高壓處理設備，HH-2數顯恒溫水浴鍋，FiveGo 單通道pH計，FD-1A-50冷凍干燥機，Nicolet 67傅里葉紅外光譜儀，F2000熒光光譜儀，TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，Synergy LX多功能酶標儀，FA25高速剪切均質機。

1.3 實驗方法1.3.1 糖基化大豆分離蛋白的制備

取4 g大豆分離蛋白溶于100 mL蒸餾水。以2 mol/L NaOH將樣品溶液pH值調節至11，磁力攪拌30 min后將SPI溶液密封于聚乙烯袋，放入超高壓處理設備中，處理壓力梯度分別設置為100、200、300、400 MPa，處理時間設置為10 min。經高壓處理后的樣品溶液轉移至燒杯中，以2 mol/L HCl調節pH值至7。向經高壓復合pH偏移處理后的100 mL蛋白溶液中加入2 g麥芽糊精，攪拌均勻后95 ℃加熱30 min，冰水浴至室溫得到糖基化大豆分離蛋白，各樣品記為100Sh-M、200Sh-M、300Sh-M、400Sh-M。未經高壓處理(0.1 MPa)而僅經pH 11偏移處理的蛋白與麥芽糊精的糖基化產物記為0.1Sh-M。

相同條件下，僅經10 min高壓處理(壓力梯度為100、200、300、400 MPa)的SPI樣品與麥芽糊精經95 ℃加熱30 min得到的糖基化產物記為100S-M、200S-M、300S-M、400S-M。未經任何處理的大豆分離蛋白作為對照組，記為SPI。SPI與麥芽糊精的糖基化產物記為0.1S-M。所有樣品于透析袋中(截留量為7 000 U)透析48 h后，進行冷凍干燥。

1.3.2 接枝度的測定

參照Shima等[12]的方法測定樣品的接枝度(DG)。OPA試劑的配制：取0.2 g OPA溶解于5 mL無水乙醇，加入0.2 g/mL SDS溶液12.5 mL、10 mmol/L四硼酸鈉溶液(pH 9.7)125 mL及β-巰基乙醇500 μL，經混勻后以蒸餾水定容至250 mL。取200 μL樣品溶液(0.2%，W/V)與4 mL OPA試劑充分混合，35 ℃水浴條件下保溫2 min后，于340 nm條件下測定反應產物的吸光值A1，未經處理的大豆分離蛋白與OPA試劑混合溶液的吸光值記為A0。接枝度(DG)按式(1)計算：

DG=(A0A1)/A0×100%

(1)

1.3.3 褐變程度測定

參照Chawla等[13]的方法，配制2 mg/mL的糖基化蛋白樣品溶液，測量時以蒸餾水為參比溶液，使用分光光度計測定各溶液在420 nm處的吸光值。

1.3.4 傅里葉紅外光譜測定

取1 mg樣品與100 mg溴化鉀粉末充分混合并研磨均勻，壓片后于紅外光譜儀艙室中進行掃描。測試條件為：掃描范圍4 000～500 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數32次。將1 600～1 700 cm-1處紅外圖譜信息導入Peak fit軟件，經基線校正后對圖譜去卷積，再進行二階導數擬合，至相關系數R2的擬合值恒定為止，各二級結構所占百分比含量為其各自對應的峰面積占比。

1.3.5 內源熒光光譜測定

將樣品溶液配制為0.5 mg/mL，設定激發波長為280 nm，發射波長掃描范圍為300～400 nm，利用熒光分光光度計掃描樣品的內源熒光光譜。

1.3.6 表面疏水性測定

參照Zhou等[14]的方法測定蛋白及糖基化樣品的表面疏水性。將樣品溶于蒸餾水中，質量濃度為0.005～0.05 mg/mL，ANS濃度配制為8 mmol/L。測定前將50 μL ANS溶液加入4 mL樣品溶液中并渦旋混勻。設定激發波長和掃描波長分別為365、484 nm。以熒光強度為縱坐標，蛋白質量濃度(mg/mL)為橫坐標作標準曲線，直線斜率即為樣品的表面疏水性(H0)。

1.3.7 乳化性測定

根據Cameron[15]的方法測定糖基化樣品的乳化活力和乳化穩定性。將樣品溶于蒸餾水，使其質量濃度為10 mg/mL，取1 mL大豆油與4 mL樣品溶液混合均勻，用高速均質機在13 000 r/min下均質2 min，制備完成后立即從乳液底部取樣10 μL，與5 mL 1 mg/mL SDS溶液混合均勻，在500 nm處測得吸光值A0。均質結束后第10 min，同樣從乳液底部取樣10 μL加入到SDS溶液中測得吸光值A10。測量時以1 mg/mL SDS溶液為參比溶液。樣品的乳化活性(EAI, m2/g)和乳化穩定性(ESI, min)按式(2)、式(3)計算。

EAI=2×2.303×A0×D/[c×(1-φ×10 000)]

(2)

ESI=A0×10/(A0-A10)

(3)

式中：D為稀釋倍數；φ為乳液油相比例；c為乳液制備前蛋白的質量濃度/mg/mL。

1.3.8 數據統計分析

實驗每組重復3次，利用SPSS軟件對數據作單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05時表示差異顯著。以Origin 2016軟件對數據進行作圖。

2 結果與討論

2.1 不同預處理方式對糖基化產物接枝度的影響

接枝度可衡量糖基化反應的程度，接枝度增加，說明體系中蛋白的自由氨基含量減少[16]。由圖1可知，僅高壓處理條件下，糖基化產物的接枝度隨壓力水平的增加而增加。這是因為高壓處理可改變蛋白結構，使蛋白分子發生解聚和結構伸展[17]，可發生接枝反應的自由氨基大量暴露于蛋白質分子表面，促使更多的自由氨基與麥芽糊精的羰基發生接枝反應，從而增大接枝程度。僅高壓處理可以促進蛋白與糖的接枝反應，這與Zheng等[18]的研究一致。相比單一高壓預處理，高壓復合pH偏移處理使接枝反應速率加快，并且隨著壓力水平的增加，接枝度也逐步增大。這可能是因為復合處理過程中，壓力水平的增大利于蛋白質結構的展開，自由氨基與羰基的接觸幾率增大，糖基化反應速率加快。

注：字母不同表示差異顯著(P<0.05)，余同。圖1 不同預處理對糖基化產物接枝度的影響

2.2 不同預處理方式對糖基化產物褐變強度的影響

美拉德反應過程中通常伴隨著褐變現象的發生，這是由于在反應的高級階段有含氮類棕色化合物生成，這類物質的特征波長為420 nm，因此420 nm處的吸光值可以指示反應的褐變程度[19]。由圖2可知，相比于天然SPI與麥芽糊精的接枝產物，對SPI僅作pH 11偏移處理，褐變程度沒有變化，說明此時蛋白的展開程度有限。僅對SPI進行高壓處理時，經100、200 MPa高壓處理后，褐變程度變化不大，當壓力達到300 MPa及以上時，褐變程度明顯增加。對SPI進行復合處理時，壓力水平增加至200 MPa時褐變強度即出現大幅度的增加，表明相較于單一高壓處理，復合處理使蛋白分子獲得了更為松散、伸展的結構，蛋白與糖的結合幾率增大，糖基化反應程度增加，生成了更多深棕色物質，因此420 nm處吸光值增大。

圖2 不同預處理對糖基化產物褐變強度的影響

2.3 SPI糖基化復合物紅外光譜分析

圖3 不同預處理對糖基化產物FTIR圖譜的影響

表1為利用酰胺Ⅰ帶處的紅外圖譜信息計算得出的不同糖基化產物的二級結構含量。根據Li等[25]的報道，各二級結構與擬合圖譜中各峰的對應關系為：1 648～1 664 cm-1為α-螺旋結構，1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1為β-折疊結構，1 664～1 681 cm-1為β-轉角結構，1 637～1 648 cm-1為無規卷曲結構。各子峰面積占酰胺Ⅰ帶總峰面積比例即為蛋白二級結構含量。見表1，相較于對照組SPI，接枝物的α-螺旋所占比例減少，而β-折疊和無規卷曲比例增大，β-轉角含量變化幅度較小。蛋白質的糖基化縮合反應位點主要位于蛋白質α-螺旋結構及其附近區域的ε-氨基，故接枝反應發生后復合物中α-螺旋結構含量降低[26]。由表中結果可知，相較于單一高壓處理，超高壓結合pH偏移處理使更多的ε-氨基參與到了接枝反應中，因此α-螺旋含量下降幅度更大。相較于β-折疊與無規卷曲的結構穩定性來說，α-螺旋的結構穩定性較強，由表1中二級結構含量的變化可推測，糖基化反應前對蛋白施加預處理可以增強后續生成的糖基化產物的分子柔性[27]。

表1 不同預處理對糖基化產物二級結構含量的影響

2.4 SPI糖基化復合物內源熒光光譜分析

蛋白質中色氨酸(Trp)等疏水性氨基酸對自身所處微環境的極性變化敏感度較高，發色團所處微環境偏極性時可導致最大發射波長(λmax)發生紅移，猝滅劑(蛋白或溶劑本身)對發色團起到熒光猝滅作用時可降低熒光強度，因此內源熒光光譜可反映蛋白質三級結構的變化程度[28]。由圖4可知，接枝物的熒光強度相比于未處理SPI明顯降低，Spotti等[29]在對乳清蛋白-葡聚糖共價復合物的研究中也發現了類似現象，并指出色氨酸殘基的周圍區域易被多糖鏈所屏蔽[30]。高壓處理可使糖基化產物的熒光強度顯著降低，并且在復合pH 11偏移處理后，熒光強度下降幅度變大，這是由于復合處理后接枝度增加，更多的麥芽糊精與蛋白發生接枝反應，從而加強了糖分子對色氨酸殘基的熒光猝滅作用。未處理SPI的熒光最大發射波長λmax位于352 nm處，而接枝物的λmax均發生了紅移，說明接枝反應可改變蛋白質的構象，使蛋白質三級結構趨于松散。這可能是由于復合處理破壞了蛋白質的結構，色氨酸殘基暴露量增多，其周圍微環境的極性增強[31]。此外，蛋白質二級結構的變化及疏水基團的暴露作用也會導致此現象的發生[32]。

圖4 不同預處理對糖基化產物內源熒光光譜的影響

2.5 SPI糖基化復合物表面疏水性分析

表面疏水性是指位于蛋白分子表面直接與極性溶液直接接觸的疏水性氨基酸數量，可影響蛋白其他功能性質的發揮[33]。不同預處理條件對蛋白糖基化產物的表面疏水性如圖5所示。與天然SPI相比，未經任何處理的SPI與麥芽糊精發生接枝反應后，其疏水性顯著降低，這是因為麥芽糊精與大豆蛋白接枝后體系內產生了大量親水性羥基，復合物的親水性增加，疏水性則會降低[20]。Zhang等[34]發現大豆蛋白-麥芽糊精的糖基化作用可降低接枝物的表面疏水性，Ma等[32]也發現糖基化反應會抑制疏水基團的暴露，這與本研究結果一致。僅高壓處理條件下，隨著壓力水平的上升，糖基化復合物的疏水性不斷升高，有研究表明超高壓處理可使蛋白分子內部的疏水性氨基酸遷移到分子表面，從而提高其疏水性[35]。pH 11偏移處理可使糖基化復合物的疏水性顯著提高，當引入超高壓(100、200 MPa)與pH 11偏移復合處理SPI后，復合物的疏水性明顯增加。盡管糖基化反應會降低復合物的表面疏水性，但糖基化前對大豆蛋白的復合預處理可削弱這種作用，使SPI發生結構伸展，內部疏水性基團從蛋白分子內部轉移至分子表面，與溶液直接接觸的疏水性基團數量增多。當引入的壓力水平增加至300、400 MPa時，糖基化反應程度增大，更多的麥芽糊精與大豆蛋白發生共價接枝，被引入的親水性羥基數量增加，接枝物的表面疏水性進一步降低。

圖5 不同預處理對糖基化產物疏水性的影響

2.6 SPI糖基化復合物乳化活性和乳化穩定性分析

蛋白質構象及其在溶液環境中的親疏水平衡決定了蛋白乳化活性及乳化穩定性的大小[36,37]。乳化活性代表蛋白質在外力作用下參與乳液界面形成的能力，乳化穩定性代表乳液液滴在一定時間內保持分散狀態，不發生絮凝和凝聚的能力[38]。由圖6可知，糖基化可使大豆蛋白的乳化活性和乳化穩定性得到顯著改善。與未經處理SPI直接進行接枝反應后所得糖基化產物相比，SPI經低壓力水平處理后再進行接枝反應所得產物，其乳化活性和乳化穩定性提升效果有限，而高壓力水平對乳化性質的改善效果更加明顯。這可能是因為壓力水平較低時，對糖基化反應的促進效果有限。當SPI經高壓協同pH 11偏移復合處理后，糖基化產物的乳化活性和乳化穩定性提升效果更加顯著。復合處理效果優于單一高壓處理的原因可能有兩點：一是因為經復合處理后，蛋白分子的空間結構松散程度變大，疏水基團暴露量增多。蛋白乳化過程中，與油相結合的疏水基團數量變多，促進了蛋白在乳液界面的吸附，從而阻止油滴發生聚合，提高其乳化性[39]。二是因為糖基化復合物中接入的糖鏈可增加蛋白膜厚度，乳化活性劑乳化穩定性得以提高[40]。

圖6 不同預處理對糖基化產物乳化活性(EAI)及乳化穩定性(ESI)的影響

3 結論

本實驗研究了超高壓協同堿性pH偏移處理對大豆分離蛋白糖基化反應的影響。結果表明：單一高壓處理或堿性pH偏移處理對糖基化反應的促進效果有限，而二者的復合處理可進一步增大糖基化反應程度，提高復合物的接枝度和褐變程度。相較于未經處理SPI，大豆蛋白經復合預處理后再與麥芽糊精經糖基化反應后所得產物，其乳化活性和乳化穩定性均有所提升。