基于有效基準特征圖譜質量表征的中藥荷葉質量評價研究

王夢林 巴寅穎 武秋紅 李文霞 路東波 高園園 孔靜 范圓圓 黃玉娟 孫仁弟 黃廣偉 姜艷艷 石任兵

荷葉為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉，具有清暑化濕、升發清陽、涼血止血的作用[1]。荷葉作為藥食同源中藥品種，在保健品領域有著廣泛的應用。荷葉的藥效作用研究主要集中在減肥、調節脂代謝、抗氧化、降血糖等方面[2-7]。荷葉化學成份類型主要涉及黃酮類、生物堿類，以及有機酸類、甾類、揮發油類、蛋白質類等[8-9]。其中黃酮類成分主要為金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、紫云英苷等[10～11]，生物堿類成分主要為荷葉堿、O-去甲荷葉堿、2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、蓮堿、去甲烏藥堿等[12-14]。2020版中國藥典以荷葉堿的含量作為荷葉飲片的質量標準[1]。另有文獻報道：采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法對荷葉中6種黃酮類成分(槲皮素、蘆丁、金絲桃苷、山奈素、紫云英苷和異鼠李素)[15]、2種黃酮類成分(蘆丁、槲皮素)和1種生物堿類成分(荷葉堿)[16]進行含量測定；采用一測多評法測定荷葉中的4種生物堿(荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿和蓮堿)含量[17]；采用HPLC法建立不同產地荷葉飲片的指紋圖譜，指認出2個黃酮類成分(蘆丁、金絲桃苷)和1個生物堿類成分(荷葉堿)，以蘆丁為參照，對11個共有指紋峰進行了相對保留時間、相對峰面積表征，對12批荷葉飲片進行相似度評價[18]；另有指認出1個黃酮類成分(槲皮素)，并以槲皮素為參照，對10個共有指紋峰進行了相對保留時間、相對峰面積表征，對10批荷葉飲片進行相似度評價[19]。

本研究在本課題組前期建立的基于藥物體系的中藥飲片質量評價模式基礎上[20-25]，進一步開展基于有效基準特征圖譜質量表征的中藥荷葉質量評價，即以確定具有降血糖作用的荷葉飲片作為飲片基準，以其有效特征指標性成分荷葉堿作為質量表征基準點，建立荷葉有效基準特征圖譜；繼而以荷葉堿對照品模擬基準點，得到11個特征峰的相對保留時間、相對峰面積；5個特征代表性成分，其中3種黃酮類成分(金絲桃苷、紫云英苷、異槲皮苷)和2種生物堿類成分(荷葉堿、O-去甲荷葉堿)的相對含量、含量換算系數；即涵蓋了荷葉的主要化學類型。并以基于此模擬基準點的荷葉飲片有效基準特征圖譜質量表征信息作為其質量評價標尺，應用于14批荷葉樣品質量優次的精準評價，同時也為有關藥物的質量有效評價和控制提供了參考。

1 材料

1.1 主要儀器

沃特世2695型高效液相色譜儀，沃特世 2998 PDA檢測器，Empower軟件系統，自動進樣器，Sartorius BT 25S型1/100 000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，Sartorius BT 124S 型1/10 000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵(上海振捷實驗設備有限公司)。

1.2 主要試藥與試劑

金絲桃苷對照品(批號B20631)、荷葉堿對照品(批號B20500)、O-去甲荷葉堿對照品(批號B51051)、異槲皮苷對照品(批號B21529)、紫云英苷對照品(批號B21704)，對照品均購自上海源葉生物科技有限公司，且純度均≥98%；乙腈(色譜級)購自 Fisher Scientific 公司；娃哈哈純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司；甲醇(分析純)，購自北京化工廠。15批荷葉飲片購自云南、北京、河北各藥店，北京中醫藥大學的劉春生教授鑒定其均為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉。15批飲片樣品現均存放于北京中醫藥大學中藥學院中藥化學系，15批荷葉飲片編號、購買地及批號、產地見表1。

表1 荷葉飲片編號、購買地、批號及產地信息

2 方法與結果

2.1 荷葉有效基準特征圖譜質量表征方法的建立

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿對照品6.85 mg、8.81 mg、2.35 mg、4.07 mg、6.48 mg，分別置于5 mL的容量瓶中，加入溶劑(70%甲醇溶液)，超聲并使其溶解后用溶劑定容至刻度線，分別搖勻，即得濃度為1.370 mg/mL、1.762 mg/mL、0.470 mg/mL、0.814 mg/mL、1.296 mg/mL的金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿對照品母液，精密吸取以上各母液適量于容量瓶中，加入70%甲醇稀釋，制備濃度為0.685 mg/mL、0.352 mg/mL、0.094 mg/mL、0.163 mg/mL、0.259 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取0.5 g荷葉飲片(基準)粗粉，精密稱定后將其轉移至50 mL錐形瓶中，精密加入30 mL 溶劑(70%甲醇)，加蓋瓶塞后稱定其質量，加熱回流提取2小時，待錐形瓶冷卻至室溫后，稱定其質量，用溶劑補足失重并搖勻，用微孔濾膜(直徑0.45 μm)濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜檢測條件 Waters XBridge C18 色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-緩沖液(B)梯度洗脫(緩沖液組成為水∶磷酸∶三乙胺= 600∶1.2∶2.4)(梯度洗脫條件見表2)，柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL/min，檢測波長為270 nm，進樣量為15 μL。混合對照品及荷葉供試品(基準)溶液的HPLC圖譜見圖1。通過11個特征峰的紫外吸收圖譜指認其所屬化學類型(如圖1)，色譜圖中所關注的11個共有特征峰分離度良好，其中，圖譜中1、2、7、10、11號特征峰屬于生物堿類化學成分，3～6、8、9號特征峰屬于黃酮類化學成分，該圖譜體現了荷葉主要化學成分類型(生物堿類和黃酮類)。11個特征峰中，5號、6號、8號特征峰分別是金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷，屬于黃酮類；7號、11號特征峰分別是O-去甲荷葉堿、荷葉堿，屬于生物堿類。

注:A 荷葉樣品(270nm); B 混合對照品(270nm);1～2、10生物堿類；3～4、9黃酮類；5金絲桃苷；6異槲皮苷；7 O-去甲荷葉堿；8紫云英苷；11荷葉堿。

表2 HPLC梯度洗脫條件

2.1.4 有效基準特征圖譜方法學考察 (1)精密度考察：分別精密吸取“2.1.2”中荷葉飲片(基準)供試品溶液15 μL，連續進樣6次，選定荷葉堿為參照峰，計算各色譜峰與參照峰的相對峰面積、相對保留時間。計算結果顯示：各色譜峰的相對峰面積、相對保留時間的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)均分別小于1.87%、1.85%，表明儀器精密度良好，并且符合特征圖譜要求(RSD≤3%)[26]。(2)穩定性考察：分別精密吸取同一個“2.1.2”中荷葉飲片(基準)供試品溶液15 μL，并于第0、2、4、8、12、24 小時分別對其進樣分析，選定荷葉堿為參照峰，計算各色譜峰與參照峰的相對峰面積、相對保留時間。計算結果顯示：各色譜峰的相對峰面積、相對保留時間的RSD均分別小于2.87%、2.75%，表明荷葉樣品溶液在24小時內穩定(RSD≤3%)[26]。(3)重復性考察：取同一批基準荷葉飲片，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，對其分別進樣分析，選定荷葉堿為參照峰，計算各色譜峰與參照峰的相對峰面積和相對保留時間。計算結果顯示：各色譜峰的相對峰面積、相對保留時間的RSD均分別小于1.99%、1.96%，說明該方法重復性良好(RSD≤3%)[26]。

2.1.5 特征代表性成分含量測定方法學考察 (1)線性關系考察：精密吸取“2.1.1”項下的混合對照品溶液，用70%甲醇溶液稀釋，制備一系列濃度不同的混合對照品溶液，按照“2.1.3”項下的色譜檢測條件進樣檢測，測定各色譜峰面積。以對照品進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制各對照品標準曲線，并計算回歸方程和相關系數。計算結果顯示，線性方程相關系數均大于0.99，符合測定要求(r≥0.99)[26]。結果見表3。(2)精密度考察：按照“2.1.3”項下的色譜檢測條件，分別精密吸取同一個“2.1.2”項下荷葉飲片(基準、S1)的供試品溶液 15 μL，連續進樣6次，測定金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿峰面積，以上各對照品峰面積RSD分別為0.83%、1.85%、1.62%、1.95%、1.26%，精密度良好(RSD均小于3%)，符合含量測定要求(RSD≤3%)[26]。(3)穩定性考察：按照“2.1.2”項下方法制備荷葉飲片(基準、S1)的供試品溶液，于室溫下放置，并于制備后第0、2、4、8、12、24 小時，按照“2.1.3”項下色譜檢測條件進樣檢測，測定金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿峰面積，以上各對照品峰面積RSD分別為1.07%、1.80%、2.27%、2.63%、1.23%(RSD均小于3%)，表明荷葉供試品溶液在24小時內穩定(RSD≤3%)[26]。(4)重復性考察：按照“2.1.2”項下方法制備同一個荷葉飲片(基準、S1)的供試品溶液，平行制備6份，進樣，按照“2.1.3”項下檢測條件，測定金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿峰面積，計算得各對照品平均含量分別為0.5497%、0.2876%、0.0911%、0.1604%、0.5005%，RSD分別為1.21%、1.57%、1.93%、1.89%、0.87%，表明此方法重復性良好(RSD≤5%)[26]。(5)加樣回收率考察：精密稱取已知含量的荷葉飲片(基準、S1)粗粉，平行稱取6份，每份約0.5 g，置6個錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液適量，然后按照“2.1.2”和“2.1.3”項下方法、色譜檢測條件分別制備供試品溶液并進樣檢測，測定峰面積后計算，金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿平均加樣回收率分別為98.72%、101.22%、100.82%、101.64%、100.59%，RSD分別為1.19%、0.54%、0.90%、1.06%、0.20%，該方法加樣回收率合格，且符合定量要求(回收率95%～105%；RSD≤3%)[26]。結果見表4。

表3 荷葉5個特征代表性成分線性關系及線性范圍(n=5)

表4 荷葉飲片5個特征性代表成分加樣回收率考察結果(n=6)

2.1.6 模擬基準點質量表征考察 選定有效特征指標性成分荷葉堿作為質量表征基準點。精密稱取4.20 mg荷葉堿對照品于5 mL容量瓶中，加70%甲醇溶液，超聲使其溶解后定容至刻度并搖勻，即得濃度為0.840 mg/mL的荷葉堿對照品母液，精密量取該對照品母液1 mL于10 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋，即得濃度為0.084 mg/mL的對照品溶液作為模擬基準點，該對照品溶液與“2.1.2”項下制備的荷葉飲片(S1)供試品溶液中所檢測的荷葉堿含量相同，按照“2.1.3”項下條件進樣檢測，得模擬基準點的HPLC色譜圖見圖2和表5。

注：11 荷葉堿

表5 荷葉質量表征基準點質量表征結果

由表5可知，荷葉堿對照品(模擬基準點)與飲片(基準)供試品中荷葉堿(實測基準點)的保留時間(min)、峰面積相對偏差絕對值均小于3%，二者基本吻合，表明本檢測方法及其測定結果、模擬荷葉質量表征基準點的準確性，即荷葉堿對照品溶液(0.084 mg/mL)可作為模擬質量表征基準點。

2.2 荷葉質量表征信息研究

有效基準特征圖譜中11個特征峰的保留時間(min)、峰面積(以100 mg荷葉飲片計)、含量，基于模擬基準點得到的相對保留時間、相對峰面積及相對含量、換算系數(特征代表性成分的相對含量與相對峰面積的比值)結果見表6。

由表6可知，基于模擬基準點得到的11個特征峰及其相對峰面積、相對保留時間，5個特征代表性成分的相對含量，即為荷葉有效質量基準標尺。

表6 荷葉飲片(基準、S1、以100 mg計)有效基準特征圖譜質量表征信息

2.3 荷葉質量評價及驗證

取14批待評價的荷葉飲片樣品粗粉，按照“2.1.2”項下的方法分別制備供試品溶液(每個樣品平行制備3份)，按照“2.1.3”項下條件進樣檢測，得到各批飲片質量表征信息，同時實測基準荷葉飲片(S1)有效基準特征圖譜，以及14批待評價荷葉飲片特征性代表性成分(金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、荷葉堿、O-去甲荷葉堿)含量，以驗證基于質量標尺對荷葉飲片進行質量評價具有準確性。結果如圖3、4、5、6以及表7所示：

注：1～2、10生物堿類；3～4、9黃酮類；5金絲桃苷；6異槲皮苷；7 O-去甲荷葉堿；8紫云英苷；11荷葉堿

圖4 14批荷葉飲片與基準(S1)相對保留時間

圖5 14批荷葉飲片與基準(S1)的相對峰面積

圖6 14批荷葉飲片與基準(S1)的相對含量

如圖3、4所示，14批荷葉飲片特征圖譜均含有11個相同的特征峰，且11個特征峰相對保留時間與實測值相吻合，與基準標尺基本一致。結果表明：14批樣品均為荷葉飲片，并且驗證了本文應用基準標尺辨別荷葉飲片真偽具有準確性。

通過圖5、6可知所關注的14批荷葉飲片的質量表征信息，綜合考量其特征峰的相對峰面積和相對含量、及其高于基準標尺對應點的數目、高出的幅度及其所涵蓋的主要化學類型及所含荷葉堿同類成分，評估得出S14、S4、S9、S13、S8、S11、S7、S6質量較優。

由表7可得，換算含量值與實測含量值基本一致(均為P>0.05)，此結果驗證了特征代表性成分換算含量結果及其相對含量結果具有準確性。

綜上所述，得出結論：可選定荷葉堿對照品作為模擬基準點，并以此模擬基準點為基準表征有效飲片基準，所表征的有效飲片基準質量表征信息可作為標尺，表征并評價待測飲片的質量。

3 討論

筆者對供試品溶液的制備方法進行考察，考察后得出：70%甲醇溶液60倍量回流提取1次，提取2小時，效果最佳，可將荷葉飲片中生物堿類和黃酮類成分提取完全，故選用此法制備供試品溶液。

在采用HPLC-PDA法建立荷葉有效基準特征圖譜質量表征方法時分別對流動相和檢測波長進行了考察，考察后得到最優色譜條件：流動相為乙腈-磷酸(0.2%)-三乙胺水(0.4%) ，檢測波長為 270 nm。

在對各特征峰峰面積進行質量表征時，峰面積均以100 mg荷葉飲片計，即，將峰面積換算為每100 mg樣品下各特征峰的峰面積，以消除由于稱樣量不同而帶來的誤差。

本研究以自然藥學觀藥物體系為導向[27-30]，以降糖有效的荷葉為飲片基準，選擇其特征指標性成分荷葉堿為質量表征基準點，以主要化學類型且具有降糖活性的特征代表性成分(金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、荷葉堿、O-去甲荷葉堿)[31-33]為質量考察指標，因而所構建的基準特征圖譜質量表征方法充分體現荷葉質量的整體性、特征性、有效性；且以荷葉堿對照品模擬基準點，實現一測多評，可使得本評價方法具有準確性、便捷性、經濟性和可行性。研究應用于對14批荷葉飲片質量優良度評價： S14、S4、S9、S13、S8、S11、S7、S6樣品質量較優。本研究以一種新的模式去評價荷葉飲片的質量，可為荷葉及其制備物質量有效精準評價與控制提供方法、模式借鑒。