手針和不同刺激參數電針干預潰瘍性結腸炎小鼠的療效差異研究

李曉璐 賈文睿 吳小麗 馮玉音 蔣海旭 黃玉嬌 劉鑫 岳炳南 臧穎穎 袁靜云 劉清國

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種反復發作的慢性炎癥性腸病，臨床表現為腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，易復發且遷延不愈，具有癌變傾向[1-2]。目前尚未有徹底根治UC的治療方法，且臨床中常用來治療UC的藥物具有一定程度的毒副作用[3]。針灸作為一種綠色療法，近年來已被廣泛應用于UC的臨床治療[4]。大量研究證明針刺可以改善結腸黏膜屏障功能并糾正機體免疫功能失常，有效降低輕中度UC患者的疾病活動指數(disease activity index，DAI)，緩解腹痛、腹瀉、便血等臨床癥狀，有效降低UC復發率[5-6]。而針刺與藥物一樣，存在量效關系，針刺劑量體現在刺激方式、刺激強度及頻率、刺激時長、治療次數及周期等方面[7-8]。因此，采用不同刺激參數會產生不同刺激量，從而導致針刺療效出現差異。本研究通過觀察UC模型小鼠體重、DAI、結腸長度、結腸組織病理變化以及結腸組織中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease-9，MMP9)的表達水平，評估手針及電針在不同刺激參數下對UC模型小鼠的療效，從而明確針刺治療UC的最佳干預方法及刺激參數，為后期深入研究針刺治療UC的作用機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Balb/c小鼠72只[北京斯貝福實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006]，體質量(21±2)g，8周齡。動物飼養于室溫(24±1)℃、濕度(55±5)%環境中，每日光照12小時，予小鼠普通飼料、自由飲水，適應性喂養3天。

1.2 主要儀器與試劑

珞亞山川牌無菌針灸針(0.16 mm×7 mm，北京珞亞山川醫療器械有限公司)，電子天平(T323S，德國Sartorius公司)，A009超分辨顯微組織成像系統(Lecia Aperio Versa，美國Leica公司)，葡聚糖硫酸鈉試劑(批號：199-08361，日本富士和光純藥株式會社)，異氟烷(R510-22，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，動物多功能麻醉機(ZS-MV-Ⅰ，北京眾實迪創科技發展有限責任公司)，韓式電針儀(型號HANS-200E，南京濟生醫療科技醫療有限公司)，大便隱血用便隱血試劑(珠海貝索生物技術有限公司)，4%多聚甲醛固定液(KGIHC016，江蘇凱基生物技術股份有限公司)，組織包埋機(KD-BMBL，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)，精密輪轉切片機(RM2235，德國Leica公司)，Anti-TNF alpha抗體[ab215188，艾博抗(上海)貿易有限公司]，電熱恒溫培養箱SHP-250(上海精宏實驗設備有限公司)，DAB顯色試劑盒(ZLI-9018，北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 模型制備方法

采用葡聚糖硫酸鈉溶液自飲法制備UC模型小鼠，除空白組外，其他各組小鼠予5%葡聚糖硫酸鈉(溶于蒸餾水，每100 mL溶液中有5 g葡聚糖硫酸鈉)自由飲水7～9天誘導建立UC模型[9-10]。

1.4 干預方法

針刺雙側“天樞”穴、“上巨虛”穴。天樞：小鼠恥骨聯合上方20 mm、中線外側5 mm；上巨虛：小鼠脛骨前結節外側2 mm、膝關節下方6 mm。以上穴位定位方法參照《實驗動物針灸手冊》[11]確定。“天樞”直刺深度約3 mm，“上巨虛”直刺深度約5 mm；采用韓式電針儀，將兩個電極分別接于同側“天樞”和“上巨虛”。使用動物多功能麻醉機及異氟烷麻醉小鼠，先將小鼠置于快速誘導箱(異氟烷濃度1.0%～1.5%)，1～2分鐘后小鼠處于休克狀態，將其取出仰臥位置于麻醉板上，口鼻處于麻醉面罩下(異氟烷濃度0.5%～1%)以維持麻醉狀態。所有電針及手針干預均在麻醉狀態下進行，空白組及模型組小鼠均需接受相同時間的麻醉處理。

1.4.1 實驗1 為比較手針以及不同波形、頻率及電流強度的電針對UC的療效差異，將42只小鼠按體重編號后隨機分為7組：空白組、模型組、電針1組(疏密波，2/100 Hz，0.3 mA)、電針2組(疏密波，2/100 Hz，0.6 mA)、電針3組(疏密波，2/100 Hz，0.9 mA)、電針4組(連續波，100 Hz，0.9 mA)、手針組(針刺雙側天樞、上巨虛)，每組6只。在實驗第7～11天對小鼠進行針刺干預。電針刺激單側天樞、上巨虛(次日換為對側，左右交替進行)，每次干預15分鐘。

1.4.2 實驗2 實驗1發現5%葡聚糖硫酸鈉造模初期炎癥較輕，后期逐漸加重，因此實驗2主要觀察電針干預在初期為小刺激量、后期大刺激量與治療期間刺激量始終不變的療效差異。將30只小鼠按體重編號后隨機分為6組：空白組、模型組、電針1組(疏密波，2/100 Hz，第3～6天：0.3 mA，第7～11天：0.9 mA)、電針2組(疏密波，2/100 Hz，0.3 mA)、電針3組(疏密波，2/100 Hz，0.9 mA)、手針組(針刺雙側天樞、上巨虛)，每組5只。在實驗第3～11天進行針刺干預，電針刺激單側天樞、上巨虛(次日換為對側，左右交替進行)，每次干預15分鐘。

1.5 取材

所有小鼠用濃度為3 mL/kg的1%戊巴比妥鈉麻醉。小鼠麻醉后開腹并充分暴露腹腔，立即在回盲部和肛門之間截取小鼠結腸組織。隨后，截取從盲腸到乙狀結腸中一段約1 cm無糞便的結腸組織，用1×PBS沖洗結腸內容物，再放于4%多聚甲醛中，以保存結腸組織細胞形態完整。

1.6 指標觀察與檢測

1.6.1 一般狀態 每天觀察各組小鼠一般狀況，包括小鼠毛色、活動狀況、精神狀態、進食飲水量等。

1.6.2 體質量 每天由同一實驗人員測量并記錄小鼠體質量。

1.6.3 DAI 每天由同一實驗人員測量并記錄小鼠糞便性狀及大便隱血情況，以計算DAI。DAI=(體質量下降分數+糞便性狀分數+便血分數)/3。體質量：不變為0分，比正常下降1%～5%為1分，下降6%～10%為2分，下降11%～15%為3分，下降16%以上為4分。正常成形的糞便評分為0分，松散、糊狀或半成形但不粘附在肛門上的糞便評分為2分，腹瀉、大便呈水樣且粘附在肛門上的糞便評分為4分[12]。根據便隱血顯色時間：立即為4分；10秒內為3分；1分鐘內為2分；1～1.5分鐘內為1分；陰性為0分。見表1。

表1 DAI評分標準[12]

1.6.4 結腸長度 取材時用直尺測量回盲部和肛門之間的結腸組織長度。

1.6.5 蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法觀察各組小鼠結腸組織的形態學改變 將固定于4%多聚甲醛中的結腸組織進行脫水處理后石蠟包埋并切片(厚約4 μm)，然后用蘇木精和伊紅染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察結腸組織形態學變化。

1.6.6 免疫組化法檢測小鼠結腸組織內TNF-α、MMP9、MPO表達水平 上述方法制成石蠟切片后，脫蠟和水化后用PBS沖洗3次(每次3分鐘)，經高溫高壓抗原修復后，加入過氧化酶阻斷劑，室溫下孵育10分鐘，PBS沖洗三次(每次3分鐘)，滴加山羊血清，室溫下孵育20分鐘，滴加一抗，4℃孵育過夜；PBS沖洗三次(每次3分鐘)，滴加辣根過氧化物酶，37℃孵育30分鐘，DAB染色后顯微鏡下觀察；自來水沖洗，蘇木素復染，PBS沖洗返藍；梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封片。TNF-α、MPO、MMP9在免疫組化中的陽性細胞被標記為棕黃色，拍照采集圖片。

1.7 統計分析

2 結果

2.1 實驗1

2.1.1 一般狀態 空白組小鼠毛發光澤、柔順，反應靈敏、喜活動，進食、飲水情況良好；模型組小鼠毛發稀疏暗淡，精神欠佳，反應遲鈍，嗜臥，進食、飲水量減少。各治療組小鼠活動增加，精神尚可，進食、飲水量較模型組增加。

2.1.2 體質量 在實驗第1天各組體質量無明顯差異，給予5%葡聚糖硫酸鈉溶液后，除空白組外，其余各組UC模型小鼠體質量均呈現明顯的下降趨勢。針刺干預后，在實驗第10、11天，電針3組體質量高于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 實驗1各組UC模型小鼠體質量變化情況

2.1.3 結腸長度 模型組小鼠結腸長度較空白組縮短(P<0.01)。針刺干預后，電針1組和電針3組小鼠結腸長度比模型組增加(P<0.05)。見表3。

組別鼠只結腸長度空白組68.74±1.18模型組65.20±0.58a電針1組66.25±0.57ab電針2組65.77±0.38a電針3組66.25±0.60ab電針4組65.73±0.30a手針組65.80±0.77a

2.1.4 組織病理學觀察 顯微鏡下觀察各組結腸組織HE染色情況。空白組小鼠結腸組織粘膜上皮完整、連續，隱窩中有大量杯狀細胞，隱窩表面規則，組織內無炎性浸潤。模型組小鼠結腸組織不完整區域較大，粘膜腺體缺失嚴重，杯狀細胞減少，隱窩萎縮且表面不規則，形成較大潰瘍，大量炎性細胞浸潤。針刺治療后，電針1組結腸黏膜較完整，但有局部炎性浸潤；電針3組結腸組織炎性浸潤減輕，隱窩表面較為規則，杯狀細胞數量較模型組增多，潰瘍減少，結腸黏膜結構較為完整。小鼠結腸組織形態正常度：電針3組優于電針1組優于電針2組優于手針組優于電針4組。見圖1。

注: A 空白組；B 模型組；C 電針1組；D 電針2組；E 電針3組；F 電針4組；G 手針組。

2.2 實驗2

2.2.1一般狀態 空白組小鼠毛色光澤，反應靈敏、喜活動，進食、飲水情況良好；模型組小鼠毛色暗淡，精神萎靡，嗜臥，進食、飲水量減少。各治療組小鼠精神、活動情況均好轉，進食、飲水量較模型組增加。

2.2.2 體質量 實驗第1天各組小鼠體質量無明顯差異，給予5%葡聚糖硫酸鈉溶液后，除空白組外，其余各組UC模型小鼠體質量均呈現明顯的下降趨勢；針刺干預后，在實驗第10天，與模型組相比，電針2組和電針3組體質量增加，差異有統計學意義(P<0.05；P<0.05)，在實驗第11天，差異仍具有統計學意義(P<0.01；P<0.05)，但電針1組和手針組體質量較模型組始終無統計學差異。見表4。

表4 實驗2各組UC模型小鼠體質量變化情況

2.2.3 DAI 給予5%葡聚糖硫酸鈉溶液后，除空白組外，其余各組UC模型小鼠DAI評分均增加。在實驗第7天，電針3組和手針組DAI評分均低于模型組(P<0.05)；在實驗第10天，電針1組、電針2組、電針3組DAI評分低于模型組，且差異有統計學意義(P<0.01)，手針組DAI值也有所降低(P<0.05)；在實驗第11天，除電針1組外，電針2組、電針3組以及手針組DAI均低于模型組(P<0.01，P<0.05，P<0.01)。見表5。

表5 實驗2不同刺激參數對UC模型小鼠DAI評分的影響

2.2.4 結腸長度 通過對比各組結腸長度發現，電針3組和手針組結腸長度均較模型組增加(P<0.01，P<0.05)，模型組與電針1組結腸長度無顯著性差異，且均較空白組有明顯縮短(P<0.01，P<0.05)。見表6。

表6 實驗2各組UC模型小鼠結腸長度

2.2.5 組織病理學觀察 對比各組經HE染色的結腸組織發現，空白組小鼠結腸組織形態正常；模型組小鼠結腸組織杯狀細胞減少，隱窩出現分支、扭曲及萎縮，黏膜缺失嚴重，大量炎性細胞浸潤。電針2組和電針3組治療后小鼠結腸組織炎性浸潤減輕，形態基本正常，杯狀細胞數量增加，黏膜較為完整，但手針組炎性浸潤仍較嚴重，杯狀細胞減少，黏膜缺損，組織形態異常。各組小鼠結腸組織形態正常度：電針3組優于電針2組優于電針1組優于手針組。見圖2。

注: A 空白組；B 模型組；C 電針1組；D 電針2組；E 電針3組；

2.2.6 TNF-α、MPO、MMP9表達水平 TNF-α表達水平：與空白組相比，模型組中TNF-α表達水平最高(P<0.01)；與模型組相比，電針1組、電針2組、電針3組TNF-α表達水平明顯降低，差異具有統計學意義(均P<0.01)，手針組TNF-α表達水平也有下降趨勢(P<0.05)。

MPO表達水平：與空白組相比，模型組中MPO表達水平最高，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，電針2組、電針3組MPO表達水平降低(均P<0.05)。

MMP9表達水平：與空白組相比，模型組中MMP9表達水平最高(P<0.01)；與模型組相比，電針1組、電針2組、電針3組、手針組MMP9表達水平明顯降低(均P<0.01)。見表7，圖3、圖4、圖5。

表7 各組UC模型小鼠結腸組織TNF-α、MPO、MMP9表達情況

注: A 空白組；B 模型組；C 電針1組；D 電針2組；E 電針3組；

注: A 空白組；B 模型組；C 電針1組；D 電針2組；E 電針3組；

3 討論

現代醫學認為UC屬于自身免疫疾病，中醫認為其屬于“泄瀉”“痢疾”“腸澼”等范疇，是以大腸濕熱、脾腎陽虛為主的本虛標實病癥。古代醫家認為針灸具有行氣活血、調和陰陽之功，常用其治療該類疾患[13]。《針灸大成》[14]中記載：“天樞理感患脾泄之危。”《針灸甲乙經》[15]云：“大腸病者，腸中切痛而鳴濯濯，冬日重感于寒即泄，當臍而痛，不能久立，與胃同侯，取巨虛上廉。”天樞穴其位在上，為大腸之募穴，可以疏調腸腑，理氣行滯；上巨虛其位在下，為大腸之下合穴，“合治內府”，兩穴相配屬上下配穴，升降相合，發揮調和腸胃的作用。研究發現針刺大腸合募穴可以有效改善腸道功能，電針上巨虛可以抑制促炎因子的表達[16-17]。因此，本研究選用天樞、上巨虛作為穴位配伍，進行針刺及電針干預治療UC。

注: A 空白組；B 模型組；C 電針1組；D 電針2組；E 電針3組；

現代研究發現針刺具有一定的抗炎作用，但其抗炎作用的發揮也依賴于不同的針刺方式和刺激參數[18-19]。本研究結果發現，不同的針刺方式和刺激參數對UC的治療效果也存在顯著差異。TNF-α是由巨噬細胞分泌的促炎細胞因子，在炎癥急性期大量釋放，參與了UC的發病，UC患者體內TNF-α水平顯著升高，且與UC病情嚴重程度呈正比[20]。MPO主要存在于中性粒細胞，在炎性反應和氧化應激反應中發揮重要作用[21]。研究發現UC患者體內MPO水平明顯增加，其高表達促使體內炎癥反應加劇，造成組織持續損傷[22]。因此，MPO的表達水平是否降低對UC的治療至關重要。MMP9主要來源于炎癥細胞和腸黏膜基質細胞，其可以降解細胞外基質，破壞細胞間緊密連接，造成黏膜損傷和加重潰瘍[23]。由此可見，TNF-α、MPO、MMP9是UC發病的重要指標。

本研究中實驗1通過對比不同波形、頻率及電流強度的電針以及手針對UC模型小鼠的體質量、結腸長度與組織形態的影響，篩選出較為有效的干預方式和刺激參數。實驗2采用實驗1篩選出的干預方式和刺激參數，并增加UC前期采用小刺激量電針干預、后期大刺激量的電針1組，以觀察其與刺激量始終不變的療效差異，

通過對比UC模型小鼠的體質量、DAI評分、結腸長度和組織形態以及小鼠結腸組織中TNF-α、MPO、MMP9的表達情況，探討針刺治療UC的最佳干預方式與刺激參數。結果證明，選擇刺激參數為0.9 mA、頻率為2/100 Hz、疏密波的電針干預治療效果更好。基于本實驗結果，進行如下討論：

3.1 不同針刺干預方式比較：電針療效優于手針

在實驗1中發現手針干預在UC早期可以有效地增加UC模型小鼠體質量，但隨著UC病情加重，體質量下降較快，說明炎癥并沒有得到有效控制。既往研究證明，電針治療UC等胃腸道疾病的療效要優于手針[24-25]。與手針相比，電針的刺激量更大且更持久，其可以持續刺激迷走神經，激活膽堿能抗炎通路，抑制腫瘤壞死因子表達；或通過脾交感神經抗炎通路釋放去甲腎上腺素，抑制外周炎性細胞因子的釋放從而發揮抗炎作用[26]。而手針刺激強度較輕，且累積的刺激量較小，對迷走神經的持續性刺激作用可能會弱于電針刺激，故手針的抗炎作用低于電針。有研究發現為期8周的電針和手針干預均能顯著降低膝骨關節炎患者循環促炎細胞因子TNF-α、白細胞介素(interleukin，IL)-1β含量，增加抗炎因子IL-13含量水平，但電針組TNF-α含量水平顯著低于手針組[27]。在實驗2中各電針組TNF-α表達水平雖然與手針組無統計學差異，但除電針1組外均低于手針組，且手針組小鼠結腸組織損傷嚴重，由此也可推測電針可以有效降低UC小鼠體內TNF-α等炎癥因子水平，其抗炎作用優于手針。

3.2 電針頻率比較：疏密波2/100 Hz優于連續波100 Hz

實驗1還對比了兩種不同電針頻率(疏密波2/100 Hz與連續波100 Hz)的治療效果。通過比較各組體重、結腸長度和結腸組織形態，發現在0.9 mA的電流強度下，疏密波2/100 Hz的療效要優于連續波100 Hz。現代研究證明疏密波2/100 Hz對小鼠胃結腸功能和外周炎癥的改善作用要優于連續波，疏密波可以增強機體的新陳代謝，促進氣血循環[28]。李勝杰等[29]發現2/100 Hz電針可以顯著降低UC模型大鼠結腸組織中的TNF-α水平。臨床研究證明，電針疏密波可以增強結腸動力，在改善病人功能性便秘方面要優于連續波[30]。實驗1中電針3組小鼠體質量較模型組顯著增加，而電針4組始終與模型組無統計學差異，且實驗2也發現電針3組小鼠結腸組織中TNF-α水平較模型組顯著降低，由此證明在電針干預UC的治療過程中，電針頻率2/100 Hz的抗炎效果優于100 Hz。

3.3 電針電流強度比較：0.9 mA優于0.3 mA、0.6 mA

兩實驗共設計了三個梯度，分別是0.3 mA、0.6 mA、0.9 mA。實驗1中電針1組(2/100 Hz，0.3 mA)、電針3組(2/100 Hz，0.9 mA)小鼠結腸長度均較模型組增加，且在實驗第11天電針3組小鼠體質量顯著高于模型組；而電針2組(2/100 Hz，0.6 mA)小鼠體質量、結腸長度始終與模型組無明顯差異。實驗2發現在實驗第7天，電針3組(0.9 mA)的DAI評分下降明顯，最先較模型組出現差異，并且電針3組小鼠結腸長度較模型組增加，而電針2組(0.3 mA)小鼠結腸長度較模型組無統計學差異。可推測電流強度太小可能無法達到電針抗炎的刺激，針刺的累積效應隨時間延長而逐漸達到高峰[7-8]，因此在合理的電流強度內，選擇較高的針刺強度有利于發揮針刺的抗炎作用。對于UC模型小鼠來說，0.9mA電流刺激強度可能是其軀體承受范圍內的有效刺激量。0.9 mA的電針刺激量不會引發對UC模型小鼠的有害刺激，同時電針的抗炎作用也充分得到了發揮。

3.4 電針電流強度與病情變化比較：全程大刺激量電針療效優于初期小刺激量、后期大刺激量

在實驗初期，實驗組預想UC早期炎癥反應較輕，可能0.3 mA刺激強度會優于0.9 mA，而到了UC晚期炎癥加劇，再使用0.9 mA刺激強度可以有效控制炎癥發展。實驗2中電針1組(第3～6天：0.3 mA、第7～11天：0.9 mA)和電針3組(第3～11天：0.9 mA)小鼠結腸組織中TNF-α、MMP9表達均較模型組顯著下降，但電針3組小鼠結腸組織中MPO的表達也較模型組顯著減少，且電針3組小鼠體質量、結腸長度較模型組明顯增加。據此推測，全程使用0.9 mA刺激強度可能持續有效激活了相應的抗炎通路，針刺效應也得到有效累積，即使隨著造模時間延長，炎癥也在可控范圍之內。因此，全程大刺激量電針療效優于初期小刺激量、后期大刺激量。

3.5 總結與展望

根據實驗1、實驗2中各治療組的體質量、DAI、結腸長度、結腸組織形態及結腸組織中TNF-α、MPO、MMP9的表達情況，證明電針治療UC小鼠的療效優于手針治療，電針最佳刺激參數為0.9 mA、2/100 Hz、疏密波。在該刺激參數下，電針可有效降低UC模型小鼠結腸組織中TNF-α、MPO、MMP9的表達，抑制炎癥發展和組織損傷。UC作為自身免疫疾病，其發病機制與免疫密切相關，因此今后的研究可從免疫炎癥角度入手，進一步探討電針如何通過調節機體免疫相關通路發揮治療UC的作用。