自然光照下補光策略對Chlamydomonas sp.JSC4生物膜除污固碳的影響

王 莎，張 華，程海翔

（1.常州工程職業技術學院 智能制造學院，江蘇 常州 213164；2.福州大學機械工程及自動化學院，福建福州 350108；3.衢州職業技術學院 機電工程學院，浙江 衢州 324000；4.衢州學院 化學與材料工程學院，浙江 衢州 324000）

0 引言

能源短缺和環境污染長期制約著生態健康和經濟社會發展。藻類作為自然界光合作用的主體，能合成油脂和碳水化合物，可吸收畜禽養殖廢水等水體中的COD、氮、磷、重金屬成分，在太陽能固定以及碳循環中起到非常重要的作用，是實現碳達峰碳中和目標的重要的生物質資源[1]。

相較于懸浮培養，生物膜方式的藻類養殖能提升微藻的去污能力、固碳力和光利用效率，同時也能節約能耗和水資源。但現有生物膜系統存在室外培養不可控因素多、適應性差的問題。首先，生物膜光傳遞效率容易受限，導致底層生物膜接收光照和養分不足，不利于生物量積累[2]。Xu研發的毛細管驅動光生物反應器，生物膜和培養基相對分離，超細滌綸纖維載體結構改善了營養物質的運輸方式，降低了能耗。該系統采用人工照明和smBG11培養基，額外增加了能耗和成本，總光合效率也僅為3.3%～4.8%[3]。Ye的異養輔助光自養生物膜培養系統提升了營養物質的傳輸效率，透光能力比普通光生物反應器提高64%，但平板式系統占地面積大，額外添加碳、氮源增加了成本[4]。以上兩項報道均是基于實驗室環境，對自然光照下生物膜生長和代謝，光照、營養物質傳輸利用機制研究還未深入開展。此外，從環保和經濟的角度看，利用自然光作為直接光源可降低培養成本，對系統的產業化應用具有重要的意義。但由于晝夜交替，以及緯度、季節、天氣等原因，光能供給具有不確定性和不可連續性。以處于低緯度（30°N～30°S）的福建省為例，2010-2018年平均日照時數為1 625.4 h，冬季平均有效光照時數僅301.2 h，屬于光輻射可利用但較貧乏區[5]。對大多數微藻而言，最佳光暗周期在12∶12～16∶8[6]。因此，依賴自然光可能會受到光能強度或光照時數不足的影響。

為探索室外自然光照時數不足條件下微藻生物膜的生長情況，改善生物膜光和營養物質傳輸效率，設計封閉式旋轉盤生物膜系統，研究不同培養體積和補光時間對生物膜積累、代謝產物、營養物去除以及固碳率的影響。試圖通過優化策略提高生物膜產率、生物燃料生產和廢水凈化效果，降低能耗和成本，探討室外環境中大規模獲取微藻生物質的可行性。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養基

藻種：衣藻（Chlamydomonas sp.JSC4），來自于中國臺灣中山大學海洋生物研究所藻種庫。育種方法及初始培養條件同文獻[7]。

培養基：試驗采用預處理過的厭氧出水的養殖廢水作為培養基。養殖廢水由福州市上街鎮溪源宮養豬場提供，經浸泡、紗布過濾（主要是去除固體懸浮物）并用蒸餾水稀釋后備用。由于初始pH值較低，試驗前采用1 mol/L NaOH溶液將pH調至7.5。為了保證廢水成分一致，同一批次試驗用水樣在-20℃速凍保存。預處理后污水的基本理化性質如表1所示。

表1 預處理后的養豬場廢水理化性質Table 1 Compositions of swine wastewater

1.2 試劑與儀器

試劑：所用試劑均為分析純，西隴化工股份有限公司生產。

儀器設備：UVmini-1240紫外可見分光光度計（島津制作所）；5B-3B（A）型多參數水質分析儀（連華科技）；FD-1000型冷凍干燥機（上海愛朗）；Li-190SA型日射強度計 （美國Li-COR）；MOT500-CO2-IR型二氧化碳檢測器（美國德康）；Minibeadbeater-16破碎儀（美國Biospec）；Vario EL III型元素分析儀（德國ELEMENTAR）；TGL-16gR高速冷凍離心機（上海安亭）；6890N-5975B氣相色譜-質譜儀（美國Agilent）等。

1.3 生物膜系統

微藻生物膜系統的架構如圖1所示。該系統由6組培養單元、CO2反應器、驅動模塊、光源等組成。每個培養單元包括儲液槽、旋轉盤及復合載體等。儲液槽（0.5 m×0.05 m×0.5 m）選用透光性好的亞克力板材料（PMMA），內部儲存培養液。旋轉盤（半徑0.25 m）垂直放置，轉盤骨架鏤空設計，重量輕。復合載體上接種濃藻液，載體為廉價的、親水性好的棉麻帆布，布置在轉盤骨架外。旋轉盤下部浸入培養液中，空間向上延伸，提高了生物膜實際生長面積，旋轉過程中微藻均勻地接受光照。CO2（5%，10 mL/min）從儲液槽頂部通入，為增加CO2吸收，保持載體濕潤，系統要保證密封性。驅動模塊由電機、減速和傳動機構等構成。光源有自然光源和可調節的LED光源。生物膜平面和光源平面垂直布置，可提高自然光受光率，且對高光強有較好的稀釋作用，控制培養單元溫度上升過快。系統運行時，驅動模塊帶動旋轉盤以15 r/min勻速轉動。由于液體表面張力，營養液沿帆布經緯線被源源不斷輸送到載體上，旋轉至一定的高度后，載體上的營養液在重力作用下逐漸擴散到未被浸潤的區域，微藻逐漸吸附在載體表面形成生物膜。

圖1 封閉式旋轉盤生物膜反應器架構示意圖Fig.1 Schematic diagram of microalgae biofilm reactor

轉盤浸沒比μ和光稀釋率Rl可分別按下面的公式計算。

式中：Am為浸沒于液體中的載體面積；Aw為轉盤面積；Ac為旋轉盤曝光面積；Al為儲液槽占地面積；n1為每個培養單元載體個數；r為旋轉盤半徑；L2為儲液槽占地面長度；W2為儲液槽占地面寬度。

1.4 試驗方案

試驗基地位于福建省福州地區大學城（119.28°E，26.08°N），時間為2020年12月。試驗分兩步開展。

步驟一：生物膜系統的基礎參數優化（A組），確定最佳培養液體積。為了減少不必要因素的影響，試驗在室內進行。試驗基礎條件：光照為LED光，有效光照為100～150μmol/（m2·s），光暗周期為16∶8，溫度為（26±2）℃，初始培養液pH為7.5±0.5，接種量為15 g/m2（干重），培養時間8 d。每隔12 h（8：00與20：00）加入40～80 mL的蒸餾水至對應的刻度線處，以補償試驗過程中培養液損耗。

步驟二：自然光照條件下的補光策略研究（B組）。首先，連續監測每天（6：00-17：00）室外自然

圖2為不同培養體積時微藻生物膜的生長及氮磷吸收情況。光照強度，評價有效光照強度及光強分布。然后，根據A組試驗得到的最佳培養體積1.5 L，設計3種補光策略（補光時間0，7 h和12 h）的對比試驗，補光方式設計見圖1。由于冬季環境氣溫較低，試驗在專門的透光性好的陽光房內進行，以保證溫度環境為26～30℃。初始培養液pH、接種量、培養天數、培養液補償等基礎條件與A組試驗相同。每天監測TN濃度的變化，在TN消耗近90%時收獲微藻。試驗設計見表2，各組試驗中每個參數做兩個平行樣。

圖2 不同培養體積時微藻生物膜的生長及氮磷吸收Fig.2 Biofilm productivity and adhesion、TN/TP removal under different volumes

表2 培養液體積與補光時間試驗設計Table 2 Medium volume and illumination time experiment

1.5 測量與計算方法

1.5.1 微藻生物質量、產油量

微藻的收獲方法及生物質干重、產油量的測量參照文獻[7]的方法進行。

1.5.2 藻體中蛋白質、碳水化合物含量和固碳率

測定微藻蛋白質、碳水化合物、固碳率時，先將微藻生物質冷凍干燥，獲得藻粉。藻粉蛋白質、碳水化合物含量采用文獻[7]的方法測定。藻粉碳含量采用元素分析儀測量。固碳率的計算式為

式中：CFR為固碳率；Cc為干細胞碳含量；MCO2為CO2的分子質量；MC為碳的分子質量；ABP為微藻生物質產率。

1.5.3廢水培養基中TN，TP的測定

TN，TP的測定分別按照《水質總氮的測定-堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》（GB 11894-1989）、《水質總磷的測定-鉬酸銨分光光度法》（GB 11893-1989）進行。

1.5.4 有效光照強度、光強分布與光合效率

有效光照強度是指到達生物膜表面附近的光照強度，測量時用光強計在生物膜表面上2 cm處沿旋轉盤一周4個位置分別讀取數據，取平均值。為表征光強的波動變化情況，用變異系數Cv衡量，其計算式為

式中：Eb為生物膜熱量；Ec為培養基有機碳量；Es為培養單元接受太陽光總能量；Ea為接受LED光源總能量；Is，Ia分別為波長介于400～700 nm的太陽光強輻照度、LED光源光強輻照度；Esl，Eal分別為太陽光與LED光單位輻照度所含的能量；Asl，Aal分別為兩種光照下的生物膜受光面積；t1，t2為光照時間；ηv為400～700 nm波長的光占總太陽光的比例；κ為COD熱值；NCOD為廢水COD濃度；V為培養基體積；Wnet為生物質總干重；LC為生物膜油脂含量；為簡化起見，假設生物質只有油脂和碳水化合物兩部分組成，則Elipid為油脂熱值；Ecarbon為碳水化合物熱值。

2 結果與分析

2.1 不同培養液體積下微藻生物膜的生長及廢水氮磷去除

由圖2（a）可知，當培養液體積從1 L增加至2.5 L時，生物膜產率先上升后下降，培養液為1.5 L時獲得最大的生物膜產率為（50.48±0.28）g/（m2·d）。生物膜固定率從（89.65±1.77）%降至（79.38±1.66）%。圖2（b）顯示TN，TP的去除率均先增加和減少，培養體積為1.5 L時達到最大的TN和TP去除率/量，分別為（93.01±0.57）%，（7.71±0.03）g/（m2·d）和（98.56±0.29）%，（1.52±0.01）g/（m2·d）。

2.2 不同培養液體積下微藻生物膜組分合成及固碳率

圖3為不同培養體積時微藻生物膜各組分含量及CO2固定率。

圖3 不同培養體積微藻生物膜組分含量及CO2固定率Fig.3 Biomass composition content and CO2 fixation under different volumes

從圖3（a）可知，隨著培養液體積的增加，蛋白質含量從（29.8±2.0）%增加到（42.63±2.0）%，碳水化合物和油脂分別從（51.68±4.60）%，（8.78±0.03）%減少到（38±5.09）%，（5.09±0.86）%，且相同培養體積下碳水化合物含量均要高于油脂含量。在培養液體積為1.5 L時達到各組成成分的最大產率，分別為（16.41±0.09），（23.38±1.83），（4.27±0.08）g/（m2·d）。圖3（b）顯示，CO2固定率隨培養液體積增加呈現先上升后下降的趨勢，1.5 L時達到了最大的固定率91.31 g/（m2·d）。

2.3 不同補光時間條件下微藻生物膜生長及廢水氮磷去除

圖4為不同補光時長下微藻生物膜生長、氮磷吸收及pH變化。

圖4 不同補光時長微藻生物膜生長、氮磷吸收及pH變化Fig.4 Biofilm productivity and adhesion、TN/TP removal and pH tendency under different illumination

由圖4（b）可知，步驟二培養到第3天時，不同補光時間組廢水TN，TP去除率均已超過90%，此時采收生物膜。生物膜生長情況如圖4（a），隨著補光時間的增加，懸浮部分和生物膜部分的生物質產率均呈現先增大后減小的趨勢。在補光時長為7 h（光暗周期為16∶8）時，生物膜部分和懸浮部分的生物質產率均達到最大值，分別為（69.77±1.17），（9.4±0.20）g/（m2·d）。隨著補光時間的延長，TN，TP去除率/量也呈現先增大后減少的趨勢，且補光7 h達到最大的去除率/量，分別為（98.85±0.80）%，（11.86±0.10）g/（m2·d）和（98.35±0.14）%，（2.17±0.01）g/（m2·d）。由圖4（c）可以看出，隨培養天數增加，不同補光策略的培養液pH上升速率不同，即補光7 h＞補光12 h＞補光0 h。補光0，12 h在第3天pH開始下降。

2.4 不同補光時間條件下微藻生物膜組分合成及固碳率

圖5為不同補光時長下微藻生物膜各組分含量及CO2固定率。

圖5 不同補光時長微藻生物膜組分含量及CO2固定率Fig.5 Biomass composition content and CO2 fixation under different illumination

由圖5（a）可知，蛋白含量在補光7 h時達到最高，為（42.81±2）%；碳水化合物含量隨補光時間的增加，從（34.43±0.95）%增加到（46.3±3.68）%，且在同一補光時間下，碳水化合物的含量都要高于油脂；脂質的含量在補光為0 h的條件下達到最大值，為（15.17±0.60）%。且蛋白質產率、碳水化合物產率及油脂產率均在補光7 h時達到最大，分別為（29.87±0.50），（27.48±1.24），（3.46±0.14）g/（m2·d）。由圖5（b）可知，隨著補光時間的增加，CO2的固定率先增大后減小，在補光7 h時CO2固定率均達到最大值（130.12±2.19）g/（m2·d）。

2.5 自然光強分布、有效光照時數及補光策略下的光合效率

圖6為自然光強分布情況、補光策略下的光合效率。

圖6 自然光強分布情況、補光策略下的光合效率Fig.6 Distribution of sunlight and biofilm photosynthetic efficiency under different illumination

圖6（a）的陰影部分表示福州地區冬季12月白天（7：00-16：00）任意時刻光照強度波動范圍。可以看出，7：00以前及16：00之后，光照強度極低，且變異系數較大[式（5）]，說明光強極不穩定。最高光強主要集中在11：00-13：00，最高值可達1 098.2μmol/（m2·s），最低值為883.5μmol/（m2·s）。綜合來看，有效光照在7：00-16：00。圖6（b）顯示補光試驗對生物膜光合效率的影響，由式（6）～（8）計算得，補光0 h時光合效率最低，補光12 h次之，補光7 h最高，可達11.8%。

3 討論

3.1 培養體積對生物膜的生長、氮磷吸收、組分合成及固碳的影響

生物膜細胞密度高，光和營養物質能夠更有效地穿透生物膜，因此參與光合作用的細胞個數多。Huang發現在一定光照下微藻生物膜內能接受有效光照的細胞占比超過40%，而對應懸浮培養僅為2.5%[9]。氮和磷作為生物膜生長重要的營養素，其吸收速率受到細胞機能、TN和TP的影響[10]。本研究中，總體上看，廢水TN，TP的去除率與微藻生物質的產率呈正相關。3種培養液中氮含量是不斷增加的。由式（1）可知，培養液為1 L時旋轉盤浸沒面積比最小，營養物質傳遞速率較慢，所以生物膜產率最低，但生物膜固定率最高。由于流體粘性，粘附在旋轉盤上的生物膜會受到一個沿旋轉方向相反的粘附力，即剪切作用，其強弱與旋轉盤的浸沒比成正比，隨著培養體積增加，生物膜固定率持續減小，這是因為載體浸沒比越大，轉盤與培養基之間的剪切作用也越大，使藻體落入培養基，這也是2.0 L時比1.5 L時生物膜產率低、懸浮部分產率高的主要原因。

合成產物方面，氮與蛋白質合成緊密相關[11]。本研究中，隨著培養液體積的增加，蛋白質含量呈現上升的趨勢。微藻光合碳的流向隨環境以及培養條件的變化而改變，其細胞組成往往有所不同[12]。在氮消耗殆盡的條件下，細胞調整碳、能量和還原劑的代謝途徑，轉移到合成不含氮的大分子（如脂質、碳水化合物）上。培養體積越少，含氮量越少，油脂和碳水化合物含量越高。但是碳水化合物和油脂的合成之間存在著競爭。在環境壓力條件下，首先合成淀粉作為能量存儲形式，然后建立長期存儲機制，即合成油脂。由式（4）可知，固碳率與微藻細胞碳含量、生物膜產率成正比，培養液為1.5 L時達到了最高的生物膜產率、油脂產率和碳水化合物產率，即該培養體積下固碳率最高。由此可以得出，高的生物質產率有利于CO2固定和生物能源生產。

3.2 補光時間對生物膜的生長、氮磷吸收、組分合成及固碳的影響

在微藻廢水處理中，光周期是重要的可控參數，對生物膜產率等有顯著影響[12]。若光照時長不足，光合作用將無法有效地進行，出現微藻黃化現象，影響初始生長速率[6]。補光0 h（光周期為9∶15），生物質產率最低。較短的光照時長相當于一個壓力信號，會促使細胞停止分裂去轉換過量的葡萄糖來儲存脂質[4]。這是因為在環境壓力（如氮抑制或光限制）下，微藻中的碳將會被分配到能量豐富的化合物中，因此引起蛋白含量的降低和能量豐富產物含量的提高。繼續增加補光時間（補光7 h，光周期為16∶8）時，生物膜生長及代謝明顯改善，這也印證了文獻中關于理想光周期的報道[6]。當光周期達到21∶3（補光12 h）時，生物質產率出現了下降，這是因為過多的光照會產生活性氧基并引起光抑制現象[13]。

微藻生物膜對氮和磷的吸收也受到光強、pH等環境因素的影響。Sukacova發現，隨著光照周期增加，磷去除率和生物膜產量持續增加。24 h自然光照下（光周期為12∶12）生物膜對磷的去除率為36%～41%，而連續人工光照下（24∶0）磷的去除率高達（97±1）%[14]。另外，pH的變化一方面能反映生物膜生長快慢，也能間接表明生物膜對廢水成分的吸收情況。以磷的去除為例，研究發現，廢水環境中磷通常以沉淀和細胞吸附等方式被吸收，磷與Ca，Mg等金屬陽離子形成難溶的磷酸鹽而沉淀，這需在較高pH（8.5～9.5）條件下進行。同時光周期內磷的去除率高于暗周期，因為在暗周期時僅有41%的磷酸鹽會被細胞吸收，約58%的磷酸鹽會再次溶解。本研究中補光7 h時生物膜生長率最高，pH上升較快，且所用廢水Ca，Mg含量較高，有利于污水中磷的沉淀和吸收。相應的，補光12 h的磷吸收率次之，補光0 h時最低?？偟膩碚f，磷的去除率/量與pH升高速率正相關，合適的光周期能促進生物膜的生長和代謝。

3.3 自然光照下微藻光合效率的提高及運用生物膜系統除污固碳的可行性

研究者在培養耐高溫富油綠藻Desmodesmus sp.F51生物膜時發現，隨著生物膜厚度增加，須提高光照才能滿足生物膜的生長，且生物膜透光性越好，微藻生長越快，自養能力越強，脂質等積聚越多[7]。Liu研究發現，在700μmol/（m2·s）高光強度且光稀釋率為10時，柵藻生物膜產率可提高至120 g/（m2·d），光合效率高達18%，室外培養時光合效率在10.8%～17.3%[12]。這表明生物膜具有較高的光耐受性和利用效率。本研究顯示，在最佳光暗周期比為16∶8和培養液體積為1.5 L時，自然光加LED補光7 h比純LED光照的生物膜產率、生物質各組分總產率、固碳率分別提高38.2%，38.1%，44.7%。補光策略論證了理想光周期條件下生物膜對室外高光強的適應性，一定程度的高光強能促進微藻光合作用和生物能源生產。

封閉式旋轉盤生物膜系統在垂直空間上擴大了微藻生物膜生長面積，一定程度上稀釋了太陽光照（光稀釋率Rl高達13.5）。盡管中午太陽光強值超過藻的光飽和點，但經稀釋后到達生物膜表面的光強在211.06～262.35μmol/（m2·s），適合微藻生長，這也間接地提高了生物膜的光飽和點和光利用效率。CO2等碳源能促進微藻生物量增加，且微藻對CO2的固定效果更好[15]。由式（1）～（3）可得該生物膜系統載體獲得較大曝光面積，CO2流通空間與生物膜接觸區域也越大，固碳量、光合效率較高。同時該系統充分利用自然光照和廢水資源，選用廉價的生物膜載體，降低了培養成本和能耗。

室外環境不穩定因素多，例如光照時長、光照強度和溫度等難以控制。完全依靠自然光照實現12∶12～16∶8的理想光周期不太現實，尤其在年光輻射量不足的地區。人工補光又增加了額外的能耗投入。因此，產業應用時要具備系統思維，加大資源融合和技術集成力度?？梢灶A見，碳達峰、碳中和背景下微藻培養與減排降耗、太陽能、風能等資源和學科交叉技術耦合發展是未來努力的方向。

4 結論

①室外環境下微藻生物膜系統可能會受到光照強度或時長不足的影響。本文設計了一款改進的封閉式旋轉盤光生物反應器，可有效提高營養物質傳輸效率和對自然光環境的適應性。

②在培養液體積為1.5 L，自然光照加補光7 h情況下，可獲得最大的生物膜產率、固碳率和碳水化合物產率，TN，TP去除率達到98%，光合作用效率高達11.80%。

③補光策略能初步改善室外環境光照不足，促進生物膜生長、氮磷成分吸收、生物燃料生產以及CO2固定，達到綠色培養微藻和除污固碳的目的。