全外顯子組測序鑒定漢族人群擴張型心肌病新的MYH7基因突變

周年偉，翁灝博，田芳艷，孟芳民，馬 靜，潘翠珍，舒先紅*

1.復旦大學附屬中山醫院心臟超聲診斷科，上海市影像醫學研究所，上海 200032 2.上海市徐匯區中心醫院，上海 200032

擴張型心肌病（dilated cardiomyopathy, DCM） 是一種原因未明的原發性心肌疾病，主要特征為心室擴大，并伴有心室收縮功能異常，早期以心律失常多見［1］。患者病情呈進行性加重，死亡可發生于疾病的任何階段。Verdonschot等［2］的臨床研究發現，人群中擴張型心肌病的發病率約為 1/2500，分子遺傳學研究發現基因突變是患者的主要病因之一。突變基因主要與心肌細胞骨架蛋白、細胞核膜、離子通道等基因有關。擴張型心肌病患者的臨床表現差異較大，從無癥狀到心律失常，嚴重者表現為心力衰竭甚至猝死。同時，擴張型心肌病與其他心肌病，如肥厚型心肌病、限制型心肌病在臨床表現及基因突變上都有重疊，相同的臨床表現可能致病基因不同，相同的基因突變可以出現不同的臨床表型，因此給臨床診治帶來較大的困難［3］。隨著基因測序技術的進步，特別是高通量測序技術的出現，基因篩查日趨精準，極大地促進了遺傳性心血管病的診斷和治療。本研究應用全外顯子組測序技術，對1個擴張型心肌病患者家系進行了致病基因的篩查。

1 資料與方法

1.1 先證者及家系資料 2019年4月復旦大學附屬中山醫院收治1例擴張型心肌病先證者（Ⅱ-3，圖1）。患者44歲，男性，反復胸悶、氣短11年，休息數分鐘后可緩解，外院診斷為擴張型心肌病，8年前患者出現頭暈、暈厥等癥狀，外院心電圖檢查示心動過緩，遂在外院植入心臟起搏器。患者 7 d前再次出現胸悶氣急、雙下肢水腫，癥狀加重，于我院急診入院，患者的心電圖（圖2A）示心房顫動，呈VVI形式起搏，帶動良好。患者超聲心動圖檢查（圖2B）示心臟明顯增大，少量心包積液，左右心室整體收縮活動減弱，左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）為33%。患者的X線胸部平片（圖2C）示心影增大。氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal prohormone of brain natriuretic peptide，NT-proBNP）顯著升高，經對癥治療后好轉。

進一步詢問家族史發現，患者哥哥及母親均有心臟病病史，且其母親既往因心臟病于32歲時去世。患者哥哥（Ⅱ-2，圖1），47歲，既往病史及檢查資料提示：心臟生化指標及冠脈CT均無明顯異常，可排除冠脈病變導致的心功能異常；進一步復查心電圖、心超等，診斷房顫、房室傳導阻滯和左心室功能不全，心臟超聲檢查（圖2D）示左室擴大伴左室收縮活動減弱，LVEF為45%，符合擴張型心肌病的診斷。

圖1 先證者的家系圖（A）及家系成員突變位點Sanger測序圖（B）

圖2 先證者家系的臨床檢查資料A：患者心電圖；B：患者的超聲心動圖；C：患者的X線胸部平片；D: 患者哥哥的超聲心動圖。

1.2 一般臨床資料 收集該家系中所有相關成員的臨床資料，包括超聲心動圖、心電圖、發病年齡、紐約心功能評級、初發癥狀、血清肌酸激酶等。同時進行體格檢查，并根據需要行動態心電圖檢查。所有研究對象簽署知情同意書后，采集其外周血標本，按照試劑盒說明書步驟提取DNA，送檢測序。本研究通過復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準［B2016-016(2)R］。

1.3 全外顯子組測序和分析 根據家系中患者及家族成員的臨床表型，對3名家族成員(Ⅰ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3，圖1）的外周血DNA行全外顯子組測序。檢測樣本抽提核酸，采用超聲打斷，用TruSeq DNA Sample Preparation 試劑盒處理兩端連接測序接頭構建成測序文庫，采用PE125格式，使用Roche Nimblegen SeqCap EZ v5.1試劑盒捕獲全外顯子區域，采用illumina XTEN平臺進行高通量測序，數據質量Q30比例大于90%，95%目標區域測序深度＞30×。原始序列讀取根據人類基因組GRCh37進行映射，并使用langya進行注釋分析，langya自動執行BWA映射和Freebayes變量調用，然后根據內部和公共數據庫以及遺傳模型擬合進行過濾。變異和臨床診斷關鍵詞被傳遞到基于科學和臨床文獻NLP的搜索引擎。篩選過濾明確致病基因突變位點，后續對家族成員的DNA進行Sanger測序以確認其基因突變位點，并對家族成員進行家族共分離驗證分析。

2 結果

2.1 全外顯子測序結果 對先證者及家系成員行全外顯子組測序，通過數據過濾及生物信息學分析發現，該擴張型心肌病患者家系的致病基因突變位點為MYH7 c.2458G＞C（p.Ala820Pro）。該位點在人群中突變頻率低，既往研究未見有報道，為漢族人群中首次發現。

2.2 MYH7基因突變位點的生物信息學分析 通過生物信息學分析（圖3）發現，該位點在不同物種中為高度保守區域。在家族成員中進一步驗證，只有先證者及其哥哥攜帶該MYH7突變位點，共分離驗證分析顯示該基因型與臨床表型在家系內表現一致。

圖3 MYH7突變位點氨基酸序列保守性分析

MYH7編碼心肌肌小節β肌球蛋白重鏈蛋白，其突變可以導致心肌肥厚及心肌收縮功能異常。本研究中發現的MYH7基因突變位點預測蛋白結構為致病，其組成蛋白結構單元中的氨基酸在不同物種間高度保守，突變之后會對蛋白功能產生較嚴重的影響，因此患者臨床表現為心臟收縮功能的異常，同時在家系其他成員中表現為心臟結構或心電活動的異常。

3 討論

擴張型心肌病以心臟擴大伴心室收縮功能障礙為主要表現，患者的預后通常較差，初次診斷后的5年存活率低于50%，晚期常死于心力衰竭，這也是心臟移植的常見原因之一［4］。遺傳和非遺傳因素在擴張型心肌病的發生和發展中共同作用，導致患者臨床表現各不相同［5-6］。目前研究［7］發現，超過 60個基因與擴張型心肌病的發生有關，部分的擴張型心肌病患者通過基因篩查找到了相關的致病的基因突變，但目前擴張型心肌病與基因突變之間關系的了解仍不全面，基因突變導致擴張型心肌病發病的機制有待進一步研究。

擴張型心肌病如能及時得到診斷治療，患者將在很大程度上減少心血管意外事件的發生。隨著基因測序技術的進步，遺傳性心肌病的基因診斷有了飛躍式進步。高通量測序技術可以在短時間內獲得大量遺傳信息，在快速尋找致病基因突變、明確診斷、精準治療和產前咨詢等方面有廣闊前 景［8-9］。同時隨著基因測序大數據的積累，科研工作者的不斷探索，基因的診斷及治療都出現了革命性的轉變，準確性及安全性都已經非常高，特別是在危重癥及疑難病的診治方面，對擴張型心肌病患者及家系成員進行基因檢測有重要價值［10］。

MYH7是人類第14號染色體上的1個基因，主要編碼心肌纖維中的β肌球蛋白重鏈。肌球蛋白是最保守的收縮蛋白，它構成肌節粗絲的主 干［11］。在心肌細胞的能量供應和維持心肌細胞內外Ca2＋的濃度中發揮重要作用，β肌球蛋白重鏈是具有酶活性的心臟收縮蛋白，可以將ATP水解成ADP和Pi，并通過肌小節的酶促動力反應和收縮偶聯機制調節心肌收縮功能［12］。MYH7基因突變相關心肌病主要包括肥厚型心肌病和擴張型心肌病［13］。本研究通過全外顯子組測序發現1個擴張型心肌病患者家系中新的MYH7突變位點，該位點在漢族人群中尚未見報道。MYH7導致心肌病的機制目前還未完全明了，既往研究［4］報道與突變導致肌小節的形態、結構和功能異常等有關。本研究中，該心肌病家系先證者在MYH7基因中存在1個新突變，攜帶該突變位點的家族成員的心功能異常，突變位點在家系內符合基因表型共分離關系。本研究中發現的罕見突變位點位于蛋白結構預測為有害的保守區域， MYH7的突變c.2458G＞ C（p.Ala820Pro）為新的漢族人群擴張型心肌病致病突變位點，后續將在更大的心肌病人群中驗證該位點的致病性，同時探尋可能的致病機制。

綜上所述，由于擴張型心肌病可在各年齡階段發病，且臨床表現差異較大，不同基因突變位點的外顯率各不相同，給臨床診斷帶來了較大困難［12,14］。全外顯子組測序能夠實現高度準確的基因突變篩查，可更廣泛地應用于檢測心肌病基因突變。

利益沖突：所有作者聲明均不存在利益沖突。