銅綠假單胞菌VgrG1a蛋白的原核表達及其人鼠嵌合型 單抗的制備與鑒定

胡心嶼，宋麗君，譚 麗，李 奇，李福龍

1.河北北方學院，張家口 075000 2.海軍軍醫大學第二附屬醫院麻醉科，上海 200003 3.河北北方學院附屬第一醫院，張家口 075000

銅綠假單胞菌是一種條件性致病菌，也是院內獲得性肺炎（hospital acquired pneumonia，HAP）的主要病原菌［1-2］。銅綠假單胞菌引發的感染多發生在免疫力低下，皮膚黏膜受損或是ICU長期體內留置氣管導管和導尿管等患者人群中［3-4］。近年來，隨著抗生素的廣泛使用，耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的數量與日俱增，越發影響著人們的健康和生活［5］。根據一項2013—2018年在美國進行的回顧性隊列研究［6］，23331例復雜尿路感染住院患者中，銅綠假單胞菌感染占三重（包括氟喹諾酮、第三代頭孢菌素、磷霉素、呋喃妥因和甲氧芐啶-磺胺甲唑中3種以上）耐藥感染的8.03%，僅次于大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌和變形桿菌。根據2018版中國成人醫院獲得性肺炎和呼吸機相關性肺炎（ventilator associated pneumonia，VAP）的診治指南［7］，銅綠假單胞菌感染占HAP的18.7%～20.0%，占VAP的12.5%～27.5%，僅次于鮑曼不動桿菌感染，并且老年患者中更多見。并且銅綠假單胞菌還可依據生存環境的不同轉化成不同的生存方式。銅綠假單胞菌可在免疫受損的宿主中引起侵襲性感染，例如急性肺炎或血液感染。但是在另外一些情況下，銅綠假單胞菌還會導致持續的慢性感染，例如患有遺傳性疾病囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）的患者，銅綠假單胞菌以生物膜的形式抵抗宿主的清除作用［8］。預防銅綠假單胞菌的感染對于減緩CF疾病的進展至關 重要。

雜交瘤技術是在體細胞融合技術基礎上發展起來的，將骨髓瘤細胞與免疫的動物脾細胞融合，形成能分泌針對抗原的高特異性抗體——單克隆抗體（單抗），在臨床上具有良好的治療效果［9］。單抗的問世及人鼠嵌合型甚至全人源抗體的出現，消除了鼠源抗體Fc導致的不良反應，為抗感染治療增加了新的方法［10-11］。最近一項關于來自康復期COVID-19患者的人單抗對SARS-CoV-2感染的治療研究［12］中，人單抗避免了發生抗體依賴性疾病加重（antibody-dependent enhancement，ADE）的風險。

纈氨酸甘氨酸重復蛋白G（VgrG）是銅綠假單胞菌Ⅵ型分泌系統（type Ⅵ secretion system，T6SS）的一種結構性蛋白，多在其尖端連接特異性的效應因子，并將其遞送到原核或真核細胞內［13］。因銅綠假單胞菌含有不同功能的效應子，所以相應地也存在可以互相匹配的不同的VgrGs［14］。部分VgrG進化出了脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸（prolinealanine-alanine-arginine，PAAR）功能結構域，產生內化上皮細胞的作用［15-16］。本研究中涉及的是經典的VgrG1a蛋白，只發揮傳送毒素的作用，目前尚未發現此蛋白的其他生物學功能。銅綠假單胞菌通過T6SS的VgrG1a分泌一種針對靶細胞能量的氧化型輔酶Ⅰ或輔酶Ⅱ NAD(P)＋，抑制原核生物生長和代謝［17］。本實驗通過原核系統表達VgrG1a蛋白，免疫小鼠制備出鼠源和人源化的單抗，為深入探討VgrG1a蛋白在銅綠假單胞菌T6SS相關感染的功能起到了鋪墊作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞和菌株 從北京擎科生物

科技有限公司購買Escherichia coliBL21（DE3）plysS；5%兔血紅細胞購自森貝伽生物科技有限公司；Expi293細胞購自Thermo公司；從上海斯萊克有限公司購買6～8周齡的BABL/c小鼠；骨髓瘤細胞P3X63Ag8.653購自中科院細胞庫。

1.2 重組質粒的構建和轉化 從NCBI網站上查找關于VgrG1a的序列信息，并將序列插入到pET-21a質粒中（添加6×His標簽和Amp抗性以備純化和篩選用）送公司合成，轉化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態，篩選陽性單菌落，即為成功表達目的蛋白VgrG1a的菌株。

1.3 VgrG1a重組蛋白的誘導表達、純化和透析置換 將表達VgrG1a的大腸桿菌在Luria-Bertani（LB）＋氨芐西林（ampicillin簡寫為Amp，1∶ 1000稀釋）培養板上活化兩代后，挑單菌落到無菌LB＋Amp（1∶1000稀釋）的液體培養基中，37℃搖床200 r/min培養至對數生長期，測600 nm處光密度為0.6～0.8時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導劑（0.5 mmol/L）。將溫度降至16℃繼續培養16 h后，離心收集菌液沉淀。

菌液于0℃超聲至透亮（10 mm探頭，每超聲3 s暫停3 s ，共破碎至少100次），13000 r/min 離心30 min分別收集上清和菌沉淀，沉淀用無菌PBS稀釋后準備SDS-PAGE分析，上清則用 0.22 μm濾頭過濾后與鎳柱混懸30 min充分結合。在填料柱中洗脫，雜蛋白用0.5×Binding Dilution（簡稱為BD）液去除至蛋白顯色液不變藍，目的蛋白用1×Binding Buffer（簡稱為BB）液洗脫至顯色液無色。將收集的目的蛋白液裝入透析袋，用含25 mmol/L HEPES（pH 8.0）的透析液置換溶劑中的咪唑，每2 h換1次透析液直至透析干凈。將目的蛋白定量測濃度后低溫保存。

1.4 VgrG1a重組蛋白的鑒定和檢測 少量上清、無菌PBS稀釋后的沉淀和透析后的目的蛋白分別加入DTT和5×Loading Buffer制成樣品，煮沸后準備SDS-PAGE用。樣品在10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳至條帶分離清晰后，用考馬斯亮藍染色，去離子水洗凈拍照。

將VgrG1a重組蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠上后120 V恒壓電泳120 min后，300 mA恒流轉膜。用TBST（Tris buffered saline Tween）緩沖液封閉后洗凈，再轉移到含多聚組氨酸標簽（His-tag）抗體的小鼠一抗稀釋液浸泡過夜。洗凈一抗后，用山羊抗小鼠IgG二抗37℃結合1 h，最后用反應液顯色。

1.5 VgrG1a重組蛋白的酶聯免疫吸附實驗 將VgrG1a蛋白濃度稀釋至1 μg/mL置于96孔酶標板中4℃過夜。用含0.05%吐溫20的PBS緩沖液洗板3次。再用5%牛血清白蛋白（BSA）于37℃封閉1 h后再次洗板，加入相應抗體（2 μg/mL）4℃過夜培養。用PBS清洗干凈后用山羊抗小鼠IgG抗體（2 μg/mL，1:10000稀釋）在37℃孵箱結合1 h后，再次清洗干凈，在四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色后加入2N硫酸溶液終止反應，測450 nm處光密度值。

1.6 抗VgrG1a蛋白鼠源單抗的制備和篩選 參考冷泉港免疫法免疫。分別在BALB/c小鼠腹股溝、尾根、頸背部皮下和腹腔注射混有弗氏佐劑（首次用完全型，其余用不完全型）的25 μg目的蛋白混懸液。每隔2周免疫，共免疫3次后尾靜脈加強免疫1次。除首次免疫蛋白量為25 μg外，其余均為12.5 μg。第5周小鼠尾尖采血200 μL，取血清進行ELISA檢測。

將免疫后的小鼠脾細胞和骨髓瘤P3X63Ag8.653細胞按照4∶1比例在聚乙二醇（PEG）的作用下進行融合，并用含10%血清的培養基終止反應。300×g室溫離心棄上清后，再用含20%血清培養基重懸融合細胞，調整密度為每孔1×105個細胞培養。融合第2天補充含HAT（H：Hypoxanthine次黃嘌呤，A：Aminopterin氨基蝶呤；T：Thymidine胸腺嘧啶核苷）的選擇培養基。第10天更換為含HT的篩選培養基。在融合2周后，未融合細胞消失，根據細胞生長情況檢測上清中特異性抗體與VgrG1a蛋白的親和力。采用有限稀釋法將雜交瘤細胞稀釋到約每孔1個細胞后，在96孔板中培養，挑選單克隆細胞檢測上清中特異性抗體與VgrG1a蛋白的親和力。

1.7 抗VgrG1a蛋白的人鼠嵌合型單抗的制備 將篩選出的鼠源單抗測序后，設計成質粒轉化大腸桿菌。提取出完整質粒，轉化Expi293細胞。37℃搖床培養48 h后收集含抗體的上清，用Protein A磁珠進行純化。

用含0.1%吐溫的Washing Buffer洗雜蛋白直至蛋白顯色液不變藍。用含0.05 mol/L檸檬酸的Elution Buffer洗脫目的蛋白（加入適量1 mol/L Tris HCl中和）直至蛋白顯色液不變藍。然后用PBS（pH 7.2）緩沖液，2800×g離心5 min置換洗脫液。使用過后的Protein A用0.1 mol/L NaOH去除蛋白后，乙醇重懸，4℃保存。

1.8 統計學處理 結果用x±s表示，關于VgrG1a重組蛋白與His標簽抗體親和力的ELISA檢驗，用多因素方差進行分析，并用Tukey法進行多重比較。檢驗水準（α）為0.05。ELISA結果均使用GraphPad Prism7.0軟件進行數據分析并繪制擬合曲線。

2 結果

2.1 VgrG1a基因表達質粒的構建、重組蛋白的誘導表達及純化后鑒定 在NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索得到銅綠假單胞菌VgrG1a蛋白的序列信息，合成得到質粒pET21a-VgrG1a。VgrG1a蛋白的相對分子質量約為72000。 將pET21a-VgrG1a質粒轉化大腸桿菌，待含pET21a-VgrG1a質粒的菌液D600達到0.6～0.8后，添加0.5 mmol/L IPTG，在搖床中200 r/min震蕩培養，觀察上清，菌沉淀和純化的蛋白中相對分子量72000處目的蛋白含量的變化。對比菌液在37℃搖床中200 r/min培養6 h的結果（圖1 A），發現最佳誘導條件為待菌液D600達到0.6～0.8后，添加0.5 mmol/L IPTG，在16℃搖床中200 r/min培養 16 h（圖1B）。

圖1 VgrG1a蛋白的表達與誘導在不同誘導條件下得到的菌液上清、菌沉淀（A）以及純化后得到的VgrG1a蛋白（B）。泳道1、6、8：Marker；泳道2、3、7：分別為37℃，6 h，0.5 mmol/L IPTG誘導后的上清、沉淀和VgrG1a蛋白；泳道4、5、9：分別為16℃，16 h，0.5 mmol/L IPTG誘導后的上清、沉淀和VgrG1a蛋白。

在16℃誘導表達的蛋白，在通過0.5倍BD洗脫液去除雜蛋白后，相對分子質量72000處條帶較明顯且含量較高，相對分子質量25000處條帶可能為目的蛋白的降解成分（圖2 A）。同樣經Western 印跡確認各條帶都含有His標簽，推測VgrG1a重組蛋白易降解（圖2 B）。

為檢測VgrG1a重組蛋白是否含有6×His標簽的目的蛋白，分別將VgrG1a蛋白和帶有6×His標簽的金黃色葡萄球菌α溶血素蛋白包被同一塊96孔酶標板（來自本課題組的金黃色葡萄球菌α溶血素為陽性對照，BSA溶液為陰性對照）。分別與抗6×His抗體溶液、小鼠IgG抗體溶液和PBS溶液過夜培養檢測其親和力（圖2 C）。并通過方差分析，檢驗得出VgrG1a重組蛋白與6×His抗體稀釋液為特異性結合，即純化后的VgrG1a重組蛋白為目的蛋白。

圖2 誘導表達的VgrG1a重組蛋白的鑒定A：VgrG1a重組蛋白的SDS-PAGE結果；B：Western印跡鑒定VgrG1a蛋白各條帶是否為6×His標記的目的蛋白（分別與抗6×His標簽的小鼠IgG一抗和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG二抗結合）；C：驗證重組蛋白與抗6×His標簽抗體稀釋液、小鼠IgG抗體稀釋液和PBS的親和力。ns：差異無統計學意義；****P＜0.0001。

2.2 VgrG1a蛋白免疫后小鼠血清抗體效價的檢測 在用原核系統表達的VgrG1a蛋白免疫BALB/c 小鼠5周后，將小鼠血清中抗體與抗原VgrG1a結合測得不同小鼠間的免疫差異（圖3）。5只小鼠編號分別為A、A34、A65、A85和A100（已排除在免疫過程中死亡的1只）。觀察在1∶640000 處稀釋倍數時，編號為A85、A65和A的小鼠血清中抗體的親和力仍較高，提示為免疫成功。

圖3 VgrG1a蛋白免疫小鼠5周后血清抗VgrG1a 蛋白抗體滴度陰性對照為同品系未免疫小鼠血清或小鼠IgG。

2.3 抗VgrG1a蛋白的鼠源單抗的制備和篩選 分別在96孔板和24孔板中進行ELISA篩選，同一種孔板篩選2次，共4次（圖4 A、4 C）。經篩選從1040株雜交瘤細胞中篩選出91個細胞，再將這91個細胞從96孔板轉移到24孔板中繼續培養，取上清測親和力，最后選出12個長勢較好且親和力較高的細胞株進行亞克隆，并挑選出4個生長良好且為單克隆的細胞3D2C9、6D9E10、6G2D9和8A4F5（圖4 B、4 D）。

圖4 兩次96孔板和兩次24孔板的ELISA篩選結果A：第1次96孔板篩選的1040株細胞ELISA結果；B：根據第1次96孔板的ELISA篩選結果，從1040株細胞中挑選出親和力較高的23株細胞到24孔板中繼續培養，取其上清再次進行ELISA檢測圖；C：第2次96孔板的ELISA結果；D：根據第2次96孔板的ELISA篩選結果，挑選出親和力較高的68株細胞到24孔板中繼續培養，取其上清再次進行ELISA檢測。陽性對照為1:500稀釋的小鼠血清。

2.4 抗VgrG1a蛋白的鼠源抗體的SDS-PAGE檢測和ELISA親和力比較 將4種抗體（3D2C9、8A4F5、6G2D9和2G5F10）分 別 進 行SDS-PAGE電泳分析，其中3D2C9、6G2D9和2G5F10在相對分子質量為55000處有1條明顯的重鏈，在相對分子質量約為30000左右有2條輕鏈，推測可能為輕鏈糖基化修飾后形成了2條帶。8A4F5抗體在相對分子質量約為30000處有1條明顯的輕鏈，在相對分子質量為55000左右有1條較粗的重鏈，推測可能為重鏈被修飾后的結果（圖5A）。通過非還原電泳分析后，4種抗體在大于相對分子質量為130000處均為一條明顯條帶，提示抗體結構完整（圖5 B）。

圖5 觀察4種抗體的還原性和非還原性SDS-PAGE電泳A：泳道1～4分別為6G2D9、2G5F10、8A4F5和3D2C9抗體進行還原性電泳，上樣量為每孔10 μg，樣品含DTT并且95℃煮沸10 min； B：泳道5～8分別為6G2D9、8A4F5、3D2C9和2G5F10抗體非變性非還原電泳（5%濃縮膠，6%分離膠），不含DTT，未煮沸。

再分別將4種蛋白［VgrG1a、銅綠假單胞菌V抗原（PcrV）、金黃色葡萄球菌γ-溶血素A（HlgA）、金黃色葡萄球菌α-溶血素突變毒素（H35L）］包被在同一塊96孔酶標板上，通過對比4種抗體與其他蛋白的親和力，檢測抗體對于VgrG1a蛋白的特異性親和力。PcrV、HlgA、H35L均為本實驗室自行制備的蛋白。經驗證，除3D2C9外，其 余3種 抗 體2G5F10、6G2D9和8A4F5均與VgrG1a蛋白特異性結合（圖6）。將抗體送公司測序得到抗體重鏈和輕鏈的氨基酸序列信息，因8A4F5抗體與VgrG1a的親和力較高且測序結果顯示為單克隆，所以選擇8A4F5抗體進行人源化（2G5F10、6G2D9和8A4F5的平衡解離常數分別為2.024×10－10、2.935×10－10和1.696× 10－10mol/L）。

圖6 4種抗VgrG1a蛋白抗體的親和力比較A～D: 6G2D9、3D2C9、8A4F5和2G5F10分別與VgrG1a、PcrV、HlgA、H35L蛋白的親和力；E：2G5F10, 6G2D9, 3D2C9和8A4F5分別與VgrG1a蛋白的親和力比較。將VgrG1a、PcrV、HlgA、H35L蛋白分別稀釋到1 μg/mL包被96孔板，4種抗體用PBS稀釋后作為一抗，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗。

2.5 抗VgrG1a蛋白的人鼠嵌合型單抗的制備及鼠源單抗和人鼠嵌合型單抗的比較 用Expi293細胞表達人鼠嵌合型單抗8A4F5后，SDS-PAGE顯示出分布清晰2條帶：相對分子質量為55000處為重鏈，相對分子質量為30000處為輕鏈（圖7 A）。在同一塊96孔板分別檢測人鼠嵌合型和鼠源性2種抗體倍比稀釋后對于VgrG1a抗原的親和力，結果顯示人鼠嵌合型8A4F5抗體與抗原VgrG1a親和力較高，半人源化成功（圖7 B）。

圖7 人鼠嵌合型單抗的制備和比較A：抗VgrG1a蛋白的人鼠嵌合型單抗的SDS-PAGE檢測，每孔上樣量為10 μg；B：抗VgrG1a蛋白的人鼠嵌合型單抗與鼠源性單抗的比較。

3 討論

銅綠假單胞菌存在多個分泌系統［18］，其中研究比較多的是T3SS，目前已有制藥公司研發了針對T3SS針頭PcrV結構蛋白的單抗，并且在臨床試驗中取得了較好的效果［19-20］。T6SS是最近幾年研究較多的分泌系統，廣泛存在于許多革蘭陰性菌中，在細菌間競爭、抗真菌等微生物生態系統或金屬離子等攝取中發揮著重要作用［21-22］。T6SS由13個保守結構組成，多由H1-T6SS基因簇編碼。VgrG1a蛋白為銅綠假單胞菌Ⅵ型分泌系統的結構蛋白，位于注射器的針頭部位，通過刺入靶細胞的細胞膜，到達細胞周質，發揮遞送效應蛋白的作 用［23］。VgrG1a不含擴展的功能結構域PAAR，與VgrG1b和VgrG1c三者同屬于經典VgrGs［24］。在銅綠假單胞菌培養上清中常能檢測到此蛋白，所以VgrGs也被當做銅綠假單胞菌的特征性蛋白。VgrG1a多以三聚體的形式存在，也可檢測到部分單體形式，故推測此蛋白穩定性可能較差［25］。

VgrG1蛋白是Ⅵ型分泌系統的核心組件，類似于噬菌體的尾巴，與收縮裝置Hcp相連，在受到外界刺激的情況下將毒素刺入原核或真核細胞內。不同菌種的VgrG1的大小和功能各不相同。銅綠假單胞菌的VgrG1約含643個氨基酸，大腸桿菌VgrG1約有841個氨基酸，而鮑曼不動桿菌的VgrG1含有1000多個氨基酸。霍亂弧菌Ⅵ型分泌系統的VgrG1是一種具有肌動蛋白交聯域（ACD）的功能蛋白，通過交聯G-肌動蛋白導致細胞骨架重排，防止被巨噬細胞吞噬［26］。在條件性致病AbCAN2型菌鮑曼不動桿菌中，既存在具有核酸酶功能的VgrG1，還存在VgrG的同源物抑制鮑曼不動桿菌T6SS的活性［27］。造成魚類敗血癥的嗜水氣單胞菌，感染豬的腸外致病大腸桿菌和植物病害相關的根癌農桿菌中也存在依賴于T6SS的VgrG1蛋白，可見Ⅵ型分泌系統影響著人們生活的方方 面面。

目前，關于銅綠假單胞菌Ⅵ型分泌系統VgrG1a蛋白在銅綠假單胞菌導致的人體感染中的具體作用尚不明確。最新的研究［17,28］指出，銅綠假單胞菌在菌間競爭中會表達Ⅵ型分泌系統，VgrG1a蛋白屬于依賴于Ⅵ型分泌系統分泌的眾多針頭蛋白的一員，VgrG1a蛋白攜帶的毒素Tse6被發現具有NAD(P)酶的作用，可通過延緩競爭菌內能量的代謝達到抑菌作用。

本研究通過大腸桿菌原核系統表達帶有6×His 標簽的VgrG1a，在通過Western印跡和ELISA實驗分別鑒定后，得出此蛋白為實驗所需目的蛋白。再用VgrG1a當作抗原，免疫BALB/c小鼠，經雜交瘤的融合和有限稀釋法篩選后，制備出特異度較高的鼠源性單抗，并完成了單抗的半人源化。此人鼠嵌合型單抗對VgrG1a蛋白顯示出良好的特異性和較高的親和力，為進一步研究VgrG1a蛋白的結構和功能及其在抗銅綠假單胞菌感染中發揮的作用奠定了基礎。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。