二苯乙烯苷、大黃素改善高糖誘導下小鼠海馬神經元凋亡

陳鋼，許永劼，黃昶煜東，林海容，楊婷婷，朱麗英，李興，潘衛△

糖尿病腦病（diabetes encephalopathy，DE）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）的慢性并發癥之一，主要表現為認知功能障礙，其發病機制復雜，且無有效的治療手段［1］。組蛋白乙酰化修飾在DM 及其并發癥的發生發展中扮演著重要角色［2］。組蛋白乙酰化轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）參與組蛋白乙酰化修飾，在一些神經退行性疾病中，兩者通過調節細胞凋亡影響突觸可塑性［3］，這與本課題組在高糖誘導的神經元細胞凋亡中發現一致［4］。因此，尋找合適的藥物調節組蛋白乙酰化，改善神經元細胞凋亡具有重要的臨床意義。何首烏是中國傳統中藥，具有增強免疫、提高DNA 修復能力等功效［5-6］，其可用于治療DM［7］。何首烏的主要成分為二苯乙烯苷（TSG）和大黃素（Emodin）［8］，前者可通過抑制細胞凋亡保護神經細胞免受損傷［9］。課題組前期研究發現，TSG 可以介導絲裂原活化蛋白激酶/c-Jun 氨基末端激酶（MAPK/JNK）信號通路，抑制海馬神經元細胞凋亡［10］。然而，在DE 中TSG 和Emodin 是否通過HAT 和HDAC 調節神經細胞的凋亡尚不清楚。本研究旨在觀察TSG 和Emodin 能否通過調節HAT和HDAC活性改善高糖誘導下的HT-22細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 小鼠海馬神經元細胞系HT-22 購于上海中喬新舟生物科技有限公司。DMEM 培養基、0.25%胰酶購于美國Gibco公司；胎牛血清購于以色列BI公司；TSG（成分：2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯2-O-β-D-葡萄糖苷；相對分子質量：406.38；規格：5 mg）和Emodin（成分：6-甲基-1,3,8-三羥基蒽醌；相對分子質量：270.24；規格：50 mg）均購于Merck 公司。CCK-8 試劑盒購于日本同仁化學研究所（Dojindo）；RIPA 高效裂解液、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡測試試劑盒購于江蘇凱基生物技術股份有限公司；HAT和HDAC酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測試試劑盒購于上海酶聯生物科技有限公司；兔源β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體、兔源B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）多克隆抗體、兔源Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）多克隆抗體、兔源胱天蛋白酶3（Caspase-3）多克隆抗體、羊抗兔二抗均購于武漢三鷹生物技術有限公司。蛋白免疫印跡（Western blot）電泳儀、IMARK型酶標儀購于美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購于美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與干預 將HT-22 細胞注入含有10%胎牛血清的DMEM 培養基中，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養24 h，當HT-22細胞在對數生長期時進行后續實驗。將HT-22細胞分為4組：對照培養基（葡萄糖濃度25 mmol/L）組（NC組）、高糖培養基（葡萄糖濃度55 mmol/L）組（HG 組）、HG+TSG組和HG+Emodin組。

1.2.2 細胞活力測定 用CCK-8檢測試劑盒測定細胞活力。將細胞密度調整為1×105/mL，每組設置5 個復孔，均勻鋪于96 孔板中，37 ℃、5%CO2的環境下培養24 h。用高糖培養基將TSG 和Emodin 稀釋至50、100、200 μmol/L，并在37 ℃、5%CO2的環境下作用12、16、20、24、48 h。在相應的作用時間結束后，棄去原培養基，加入細胞活性檢測試劑（10 μL CCK-8 檢測試劑，90μL 培養基），避光置于37 ℃、5%CO2的培養箱中孵育2.5 h。用酶標儀在波長為450 nm處檢測光密度（OD）值。細胞存活率=（TSG/Emodin 組OD 均值-空白組OD 均值）/（NC/HG 組OD 均值-空白組OD 均值）×100%。選擇最適條件（細胞存活率為70%左右）后繼續實驗。

1.2.3 細胞凋亡率的檢測 細胞經藥物作用24 h后，用PBS清洗3 次，加入0.125%胰蛋白酶消化細胞，用培養基終止消化后，1 000 r/min離心5 min，收集細胞。加入500μL結合緩沖液（Binding Buffer）將細胞重懸，并依次加入Annexin VFITC 和Propidium Iodide 各5 μL，室溫避光作用10 min 后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組重復3次。

1.2.4 ELISA 法檢測HDAC 和HAT 活性 在96 孔板中加入每組細胞裂解液各50μL，每組設4個復孔。每孔加入100μL辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔抗體，孵育、洗滌后加入100μL顯色劑，避光15 min，加入終止液50μL。用酶標儀在波長為450 nm處檢測OD值。

1.2.5 Western blot檢測凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達 對各組細胞進行Western blot分析。用細胞裂解液RIPA裂解細胞。蛋白濃度測定采用BCA 試劑盒。每孔蛋白量為30 μg，通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。室溫條件下5%脫脂牛奶封閉2 h。TBST洗滌3次，每次10 min。分別加入相應的一抗β-actin 抗體（1∶5 000）、Bax 抗體（1∶1 000）、Bcl-2抗體（1∶1 000）、Caspase-3抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。孵育后，用TBST 洗滌3 次，每次10 min。用羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。最后通過增強型化學發光（ECL）檢測系統進行檢測。每組重復3 次。結果用Image J 1.8.0軟件進行灰度值分析。

1.3 統計學方法 使用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析。數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TSG和Emodin的最適作用時間和濃度 CCK-8 實驗結果顯示，TSG 和Emodin 在50 μmol/L 作用HT-22 細 胞12 h 的 條 件 下，HG+TSG 組 和HG+Emodin 組細胞存活率在85%左右；作用48 h 時，HG+TSG 組 和HG+Emodin 組 細 胞 存 活 率＞75%。100μmol/L 的TSG 和Emodin 作用細胞48 h 時，HG+TSG 組和HG+Emodin 組細胞存活率分別為76%和70%。200μmol/L 的TSG 作用細胞48 h時，HG+TSG組細胞存活率在70%左右。因此選擇TSG 以200μmol/L，Emodin 以100 μmol/L 作用HT-22 細胞48 h為最適條件，見圖1。

Fig.1 The effects of different action concentrations and time points of TSG and Emodin on HT-22 cell viability圖1 TSG和Emodin不同作用濃度和時間對HT-22細胞活性的影響

2.2 TSG 和Emodin 改善高糖環境下神經元細胞凋亡率 流式細胞術結果顯示，與NC組相比，HG組細胞凋亡率顯著升高，TSG 和Emodin 可顯著降低高糖條件下的細胞凋亡率（P＜0.01），見圖2。

Fig.2 Apoptosis rates of HT-22 cells in different groups圖2 不同組間HT-22細胞凋亡率

2.3 TSG 和Emodin 調控高糖誘導HAT 和HDAC 的表達 ELISA結果顯示，與NC組相比，HG組的HAT和HDAC 活性上調（P＜0.05），經過TSG 干預后，HAT 活性顯著下調，HDAC 活性上調；經過Emodin干預后，HAT 和HDAC 活性均顯著下調（P＜0.05），見表1。

2.4 TSG 和Emodin 調控凋亡相關蛋白的表達 Western blot 結果顯示，與NC 組相比，HG 組Bax、Caspase-3 的表達升高，Bcl-2 的表達降低，而HG+TSG組和HG+Emodin組可有效逆轉高糖誘導的Bax、Caspase-3升高及Bcl-2的降低（P＜0.01），HG+Emodin組Bax、Caspase-3及Bcl-2的表達與NC組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3、表2。

Tab.1 Comparison of HAT and HDAC activities in HT-22 cells between the different groups表1 各組間HT-22細胞HAT和HDAC活性比較（n=4，OD450，±s）

Tab.1 Comparison of HAT and HDAC activities in HT-22 cells between the different groups表1 各組間HT-22細胞HAT和HDAC活性比較（n=4，OD450，±s）

**P＜0.01；a與NC組比較，b與HG組比較，P＜0.05。

組別NC組HG組HG+TSG組HG+Emodin組F HAT 0.64±0.02 0.79±0.02a 0.68±0.03ab 0.46±0.02ab 158.140**HDAC 0.61±0.03 1.12±0.06a 1.18±0.02ab 0.74±0.04ab 227.551**

Fig.3 Expression levels of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 protein detected by Western blot assay in the four groups圖3 Western blot檢測各組細胞Bax、Bcl-2和Caspase-3的蛋白表達

Tab.2 Comparison of expression levels of apoptosisrelated proteins between the four groups表2 各組細胞凋亡相關蛋白表達水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of apoptosisrelated proteins between the four groups表2 各組細胞凋亡相關蛋白表達水平比較（n=3，±s）

**P＜0.01；a與NC組比較，b與HG組比較，P＜0.05。

組別NC組HG組HG+TSG組HG+Emodin組F Bax 0.57±0.04 0.93±0.06a 0.71±0.04ab 0.64±0.03b 43.482**Bcl-2 0.61±0.03 0.41±0.02a 0.53±0.04ab 0.60±0.01b 35.912**Caspase-3 0.63±0.00 0.88±0.05a 0.65±0.03b 0.65±0.05b 33.111**

3 討論

目前，DE 的發病機制不明，且尚未找到有效的治療靶點。課題組前期研究發現何首烏對DE 認知功能障礙具有預防和治療作用［11］。本研究采用何首烏有效成分TSG和Emodin進行干預，發現兩者可以調節HAT 及HDAC 的表達，改善高糖誘導的海馬神經元細胞凋亡。

3.1 TSG 和Emodin 作用神經元細胞的最佳濃度和時間 盡管有文獻報道了TSG作用于大腸癌細胞的最適藥物濃度［12］，但對于不同的細胞，最佳的藥物作用濃度和時間不盡相同。陳素領等［13］采用1、10、20、50、100μmol/L 的Emodin 處理HT-22 細胞，但未對時間進行確定。本研究通過CCK-8 法檢測細胞活性，篩選出TSG 和Emodin 作用HT-22 細胞的最佳濃度和時間，推薦作用濃度和時間分別為TSG 200μmol/L 48 h和Emodin 100μmol/L 48 h。

3.2 TSG 和Emodin 改善高糖誘導下神經元細胞凋亡 海馬神經元凋亡導致認知功能障礙是DE 的重要發病機制之一。研究發現，海馬神經元受線粒體凋亡通路、內質網凋亡通路和死亡受體通路的調控，最終影響認知功能障礙［14-15］。TSG和Emodin在改善神經元凋亡和神經退行性疾病中起到重要的作用。Lee 等［16］以HT-22 細胞為研究對象，以何首烏主要活性成分TSG 作用于氧化應激后的細胞，結果顯示TSG可以通過減少活性氧（ROS）的產生減少海馬神經元細胞凋亡。近期研究表明，Emodin可以通過抑制乳酸脫氫酶（LDH）活性和Caspase-3、-8、-9 的激活來抑制神經元細胞的凋亡，從而改善阿爾茨海默病小鼠的空間記憶和學習能力［17］。但是TSG 和Emodin 能否有效改善高糖所致的神經元細胞凋亡卻少見報道。本研究顯示，在高糖環境下HT-22 細胞凋亡率升高，經TSG 和Emodin 干預后，HT-22 細胞凋亡率下降；在蛋白水平上，Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達得到恢復。這些結果表明TSG和Emodin可以改善高糖誘導的神經細胞凋亡。

3.3 TSG 和Emodin 通過調節HAT 和HDAC 活性改善高糖誘導下神經元細胞凋亡 神經元細胞凋亡與組蛋白乙酰化密切相關，而組蛋白乙酰化修飾受到HAT 和HDAC 的調控［18］。Wu 等［19］研究發現，神經元細胞凋亡受HAT 和HDAC 的動態調控。一般控制核苷酸合成5（GCN5）是組蛋白乙酰化轉移酶，當GCN5失活時，導致Bcl-2相互作用細胞凋亡調節因子（Bim）轉錄上調，促進神經細胞凋亡，而抑制HDAC 后可以顯著挽救GCN5 失活誘導的神經細胞凋亡。課題組前期研究發現，高糖作用下的HT-22神經元細胞HAT 和HDAC 表達升高，細胞凋亡增加，且抑制HDAC 后加劇了HT-22 細胞凋亡［4］。因此，在DE 的發生發展中，神經元細胞組蛋白乙酰化調控異常是導致神經元細胞凋亡的關鍵因素之一。本研究發現，在高糖條件下，TSG 和Emodin 可以調控HAT 和HDAC，且兩者均能下調神經元細胞的凋亡率和改善神經元細胞中凋亡蛋白的表達，這些結果表明TSG 和Emodin 可能通過調節組蛋白乙酰化酶，從而減少神經元細胞凋亡。本研究或許可為將來DE的新藥開發提供一定的理論支撐。然而，本研究未從體內實驗證明TSG和Emodin在DE大鼠海馬神經元細胞中的調控關系，這是后續研究的重點。

綜上所述，在高糖環境下，海馬神經元細胞組蛋白乙酰化酶失調，導致神經元細胞凋亡，而TSG 和Emodin可以改善這一過程，因此TSG和Emodin可能在調控DE 中的組蛋白乙酰化酶失調及減少神經元細胞凋亡方面具有較好的應用前景，為進一步開展體內實驗奠定了基礎。