產前應激致抑郁樣子代大鼠海馬磷酸化蛋白質和代謝產物變化的初步研究

何 威，孫宏利，黃惠梅，李清紅

(1.西安市兒童醫院 陜西省兒科疾病研究所 陜西省兒童疾病精準醫學重點實驗室，陜西 西安 710003；2.西安市兒童醫院腎臟內科，陜西 西安710003；3.西北婦女兒童醫院新生兒科，陜西 西安 710061)

抑郁癥是一種常見的慢性精神類疾病，影響思維、情緒和身體健康，主要表現為情緒低落、缺乏活力、悲傷、睡眠障礙及生活質量差[1]。迄今為止抑郁癥缺乏滿意的治療方案。研究表明，胎兒對應激異常敏感，懷孕期間暴露于不良事件、自然災害及母親的抑郁癥狀會增加子代出現情緒、行為和/或認知問題的風險[2]，這種影響可能延續至整個成年期[3]。目前關于產前應激(prenatal stress，PS)如何增加子代抑郁樣行為易感性的機制研究較少。

海馬是抑郁癥患者大腦中備受關注的區域之一。海馬通過抑制下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸活動，廣泛地參與大腦認知和情感處理過程，從而在應激反應中發揮重要作用。Meta分析顯示，成年抑郁癥患者海馬的體積減少約5%[4]。PS與子代海馬的功能和微觀結構改變有關，胎兒期的海馬發育較易受到PS的影響[5]。海馬的結構及分子改變可能在抑郁癥的病理學機制中扮演重要的角色。本研究結合磷酸化蛋白質組學和代謝組學研究PS誘導抑郁樣子代大鼠大腦海馬的蛋白質磷酸化和代謝的改變及生物相關性，為精神系統疾病與環境因素、遺傳因素之間建立了新的機制聯系，為臨床抑郁癥的治療或輔助治療提供新的見解。

1 資料與方法

1.1 產前慢性束縛應激動物模型的建立及實驗分組

本實驗采用Sprague-Dawley大鼠，體重約為230～300g，置于22℃及12h的暗/光循環環境中，自由攝食飲水。所有實驗均獲得西安交通大學實驗動物管理委員會批準。

將雌性和雄性大鼠于晚上20:00～22:00以3∶1比例交配。次日早晨7:00～8:00對雌性大鼠進行陰道涂片檢查，若精子呈陽性被記為妊娠第0d并單籠飼養。懷孕母鼠被隨機分為對照組(n=8)和PS組(n=8)。慢性束縛應激模型建立參考課題組已發表文獻[6]。分娩后，從每窩隨機選擇1～2只雄性子鼠用于后續實驗。

1.2 行為學實驗

1.2.1糖水偏好實驗(sucrose preference test，SPT)

隨機選取45只1月齡雄性子鼠進行SPT，用于對子代大鼠PS易感性的評估。實驗前，在大鼠籠中放置1%蔗糖水進行24h的適應性練習。禁水禁食24h后，于次日早晨8:00～9:00進行SPT。向大鼠隨機提供1瓶飲用水和1瓶1%蔗糖水溶液(容量相當)。1h后，分別測量糖水和飲用水攝入量，計算公式為蔗糖偏好百分比=糖水消耗量/(糖水消耗量+飲用水消耗量)×100%。與對照組相比蔗糖偏好百分比下降30%以上的雄性大鼠判定為PS-S(PS-Susceptibility)子代大鼠。

1.2.2 其他行為學實驗

SPT完成后，隨機選取PS-S組和CON組(對照組)各8只進行曠場實驗(open field test，OFT)、強迫游泳實驗(forced swim test，FST)、懸尾實驗(tail suspension test，TST)并記錄實驗結果。上述行為學實驗完成后，將大鼠麻醉。冰上取出全腦，快速從大腦中分離出海馬組織，-80℃備用。

1.3 蛋白質組質譜采集

使用組織裂解液提取海馬組織總蛋白，二喹啉甲酸蛋白檢測法測定蛋白質濃度。取適量蛋白質用胰蛋白酶消化后使用C18 Cartridge對酶解肽段進行脫鹽、去除高尿素，真空離心干燥后在40μL溶解緩沖液中復溶。根據串聯質譜標簽(tandem mass tags，TMT)標記試劑盒說明，每個樣品各取100μg肽段用于TMT標記。將標記后的混合肽段溶液真空凍干，然后用磷酸化肽段富集試劑盒富集，濃縮的磷酸肽溶液凍干并復溶在20μL 0.1%甲酸溶液中，用于液相串聯質譜(liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。

樣品用液相系統進行鳥槍蛋白質組學分析。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為84%乙腈-0.1%甲酸水溶液。色譜柱以95% A預平衡30min，將磷酸肽轉移到nanoViper C18色譜柱上，流速為300nL/min。經過C18-A2分析柱分離后，用Q-Exactive型質譜儀對肽樣進行檢測。使用MaxQuant軟件提取并分析原始數據。根據倍數變化大于1.2或小于0.83和P<0.05的篩選標準，確定差異表達磷酸化肽段。

1.4 非靶向代謝組質譜采集

每個樣品取5mg海馬勻漿懸浮在800μL預冷的甲醇：乙腈溶液(1∶1，v/v)中。渦旋后，超聲30min，重復兩次。-20℃ 放置60min，14 000r/min 4℃離心15min。

將上清液注入Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統。流動相組成A：水+25mmol/L乙酸銨+25mmol/L氨水，B：乙腈。梯度洗脫程序：0～1min，95% B；1～14min，線性降至65% B；14～16min，線性降至40% B；16～18min，維持在40% B；18～18.1min，線性升至95% B；18.1～23min，維持在95% B。將分離的代謝產物使用AB Triple TOF 5600質譜儀進行質譜分析，分別以電噴霧離子源正離子和負離子模式檢測。

使用ProteoWizardConver軟件將原始數據轉換為mzML格式，然后使用XCMS程序校準保留時間、提取峰面積、標準化數據。通過精確質量數(m/z tolerance±30ppm,RT tolerance±60s)、二級質譜數據與實驗室自建數據庫數據雙重匹配的方式鑒定代謝產物種類。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 PS-S大鼠的行為學評估

采用SPT將PS易感性子代大鼠設定為PS-S組(38.78%)。與對照組相比，PS-S子代大鼠在OFT的穿越總格數、中心格數、直立次數和在中央格內的停留時間顯著減少(t值分別為14.70、6.396、9.058、14.27，P<0.05)，在FST和TST中的不動時間顯著延長(t值分別為17.70、8.751，P<0.05)。這些結果證實了PS模型和SPT篩選條件的有效性。

2.2 PS對PS-S大鼠大腦海馬磷酸化蛋白質組學和代謝組學的影響

研究使用TMT技術標記肽段、固相金屬親和色譜技術分離富集磷酸化多肽，隨后采用高分辨液相色譜-串聯質譜收集PS-S大鼠的磷酸化蛋白質組學數據，分別檢測并量化了2 978個磷酸化蛋白質，6 790個磷酸化肽段，9 817個磷酸化位點。與對照組相比，篩選出197個(6%)差異表達的磷酸化肽段(其中140個豐度升高，57個豐度下降)，見表1。同時研究采用超高效液相色譜系統分離代謝產物，并使用Triple-TOF質譜儀檢測上述樣本獲得非靶向代謝組學數據，在ESI正離子和負離子模式下分別檢測到8 622和11 119個離子峰。分析正負離子峰共有80個差異代謝產物出現相對豐度的顯著變化(其中55個升高，25個下降)，見表1。

表1 差異磷酸化肽段/代謝產物結果統計表Table 1 Statistics of deferential phosphor-peptides/metabolites

2.3 KEGG代謝通路注釋比較及富集分析

本研究對差異表達磷酸化肽段與代謝產物所屬的KEGG通路進行統計，發現差異分子共同參與44條代謝通路，以韋恩圖形式展示，見圖1A。將KEGG通路中同時被注釋到差異分子數量最多的前10個KEGG通路界定為主要的共有通路，條目名稱和被注釋到的差異分子數量以柱狀圖形式展示，見圖1B。結果顯示兩個組學的差異分子共同富集的KEGG通路主要包括膽堿能突觸、長時程增強、晝夜夾帶、甘油磷脂代謝、內源性大麻素信號、促性腺激素釋放激素信號通路、催產素信號通路和醛固酮的合成及分泌信號通路，這些主要共有通路可能參與了PS導致子代抑郁樣行為的生物學機制。

2.4 組學數據相關性分析

本研究構建了基于Pearson相關系數的矩陣熱圖，根據其表達特征可以將差異磷酸化肽段分成兩組，組內彼此呈正相關關系，組間彼此呈負相關關系，見圖2。

注：A差異磷酸化肽段(藍色)和差異代謝產物(黃色)參與通路的韋恩圖；B包含差異磷酸化肽段(藍色)和代謝產物(橘色)數量最多的前10個KEGG通路柱狀圖。圖1 多組學數據KEGG通路可視化分析圖Fig.1 KEGG pathway visualization analysis of multi-omics data

注：橫坐標和左側縱坐標均代表顯著差異修飾肽段及代謝產物。右側縱坐標是Pearson相關系數r，r>0表示正相關(紅色)，r<0表示負相關(藍色)；顏色越深表示相關性越強。圖2 顯著差異磷酸化肽段與顯著差異代謝產物的Pearson相關系數矩陣熱圖Fig.2 Heat map of pearson correlation matrix of all significantly differential phosphor-peptides and metabolites

隨后本研究對滿足相關系數值r≥0.50和P<0.05的差異磷酸化肽段和代謝產物，構建網絡互作關系，用以篩選影響整體代謝或信號轉導途徑的、最關鍵的磷酸化蛋白質或代謝產物節點，分析發現膽堿、磷酸乙醇胺、磷酸二羥基丙酮、腺嘌呤、蘋果酸、谷胱甘肽二硫化物等代謝產物與多個磷酸化肽段密切相關；CamkⅡa、Mbp、Ttll7、Arpp19、Gsto1、Dgkz、Adcy9等多個蛋白的磷酸化肽段與多個代謝產物密切相關(P<0.05)。

3 討論

3.1 多組學研究及應用進展

組學作為現代常用的高通量檢測手段具備強大的生物信息學解析能力，已成為揭示疾病嚴重程度、預后轉歸、篩查預測疾病生物標志物的有力工具，可為疾病病理機制和治療方案提供新視角[7]。多組學分析在免疫炎癥[8]、腫瘤[9]、中樞神經系統發育[10]等疾病研究中均有應用報道。

3.2 膽堿能突觸信號通路失調

有研究表明抑郁癥對大腦膽堿(choline，Cho)水平有顯著影響[11]，其差異程度與抑郁癥的嚴重程度正相關[12]，且子代表現較少的社會退縮行為與母親產前Cho水平正相關[11]。Cho作為調節記憶儲存的關鍵神經遞質——乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)的前體，通過反饋機制在Ach釋放調節中起重要作用。膽堿誘導突觸前α7-nAChR激活導致ACh釋放下調。這一級聯反應有賴于鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II，CamkII)的活性[13]。

CamkⅡ，一種普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是突觸后致密物的主要組成部分。在突觸可塑性、學習和記憶中起關鍵作用，通過調節樹突棘上的離子型谷氨酸受體和突觸后致密物影響突觸功能[14]。CamkⅡ各亞型突變會導致小鼠嚴重的可塑性及學習障礙，各亞型具有獨特的生理功能且高度同源[15-16]。CamkⅡ的三個亞型CamkⅡa、CamkⅡb、CamkⅡg在PS-S大鼠海馬中均出現了顯著的磷酸化水平改變。CamkⅡ與抑郁癥的相關研究較少，推測CamkⅡ的磷酸化水平改變可能導致突觸功能受損，從而在PS致子代抑郁樣行為的過程中發揮重要作用，或可成為深入研究該誘導機制的新思路。

本研究發現CamkⅡ的三個亞型磷酸化水平改變的同時，共同參與膽堿能突觸途徑的代謝產物膽堿含量在PS-S大鼠海馬中也發生了變化。上述4個分子是差異磷酸化肽段和代謝產物構建的網絡互作關系中的關鍵節點，很可能作為海馬區域影響整體代謝或信號轉導途徑的關鍵磷酸化蛋白質或代謝產物發揮作用。

3.3 長時程增強信號通路失調

N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)在中樞興奮性突觸的可塑性中起重要作用[17]，目前認為編碼NMDAR亞單位的Grin2a是癲癇的致病基因，該基因突變與神經發育障礙密切相關[18]，且在女性抑郁癥患者中水平較高[19]，母嬰分離應激會增加子代成年大鼠海馬中Grin2a的轉錄水平[20]。本研究發現Grin2a磷酸化水平在PS-S大鼠大腦海馬中顯著增高，推測子代胚胎期發育過程受PS影響，調節Grin2a的內源性磷酸化水平升高，最終導致NMDAR的轉運減少及突觸可塑性受損，該蛋白的磷酸化水平改變可能在PS誘導中起關鍵作用。

整合富集分析顯示差異磷酸化肽段和差異代謝產物顯著富集在長時程增強(long-term potentiation，LTP)等谷氨酸代謝途徑，包含4個磷酸化肽段Grin2a、Cacna1c、Adcy9、Shank3和1個代謝產物L-谷氨酸。本研究為長時程增強等谷氨酸系統失調參與抑郁癥的發病機制提供佐證。

NMDAR活化及Ca2+內流可以觸發谷氨酸能傳遞的LTP[21]。僅當谷氨酸從突觸前末端釋放時，才能活化NMDAR，使Ca2+通過NMDAR進入突觸并觸發后續多個級聯效應。在LTP中，CamkⅡ被Ca2+激活并自身磷酸化[21]，隨后轉移到突觸與NMDAR結合，LTP過程需要CamkⅡ的激活，CamkⅡ作為NMDAR依賴性LTP的關鍵酶發揮核心作用[22]。有研究發現NMDAR抑制劑和CamkⅡ抑制劑均可以降低CamkⅡ磷酸化水平[23]。大量證據表明CamkⅡ與NMDAR的相互作用在維持突觸強度方面起重要作用。

本研究中，突觸相關蛋白Grin2a、CamkⅡa、CamkⅡb、CamkⅡg的磷酸化修飾水平異常及L-谷氨酸的代謝異常，提示膽堿能突觸及相關的LTP信號通路，在PS誘導抑郁樣子代大鼠海馬的分子變化中發揮著主要作用，很可能是該區域差異分子產生的核心調控機制。