乙醛脫氫酶 ALDH4A1 的生物信息學分析

賀繼平，陳曉聰，蘇曉云，門杰，鄒雙玲

（山西醫科大學汾陽學院，山西 汾陽 032200）

0 引言

動脈粥樣硬化（ atherosclerosis,AS）是一種對人體健康有害的最常見的慢性心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）[1]，發病率和死亡率較高，約占世界死亡總人數的20%[2]。AS是一種慢性炎癥性疾病，炎癥是AS發生和發展過程中存在共同生理、病理基礎[3]。對于AS主要研究集中在機制[4-5]、治療[6]和預防[7-8]等方面。炎癥對AS斑塊的發生和發展起重要的作用，AS炎癥發展的標志物C反應蛋白、白細胞介素（IL）-6、黏附分子、基質金屬蛋白酶等作為研究重點，并取得一定成果。Cristina Lorenzo等[9]，通過高通量測序研究發現，線粒體蛋白ALDH4A1是一種與AS有關的自身抗原，ALDH4Al在AS過程中分布改變，在AS小鼠和人類患者體內表達增加，ALDH4Al可以作為AS治療的潛在標志物。本研究利用在線生物信息學軟件分析ALDH4Al基因及其編碼蛋白的結構和功能，為ALDH4A1 抗體治療AS的發生發展提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

從國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載褐家鼠蛋白序列，GenBank檢索號為P0C2X9.1。

1.2 蛋白理化性質的分析

利用在線分析軟件ProtParam對褐家鼠ALDH4A1蛋白氨基酸的組成、分子量、不穩定指數、等電點、消光系數、平均親水系數及脂溶系數等理化性質進行預測。用TMHMM Serverv.2.0對該蛋白進行跨膜螺旋預測。用ExPAsy對該蛋白的親水性或疏水性進行預測。

1.3 蛋白功能位點的分析

用NetPhos 3.1 Server預測褐家鼠ALDH4A1蛋白的磷酸化位點。用SignaIP 4.1 分析ALDH4A1蛋白信號肽。用NetNGlyc1.0Server分析該蛋白N-糖基化位點，分析褐家鼠ALDH4A1蛋白的O-糖基化位點。

1.4 蛋白二、三級結構的構建

利用Prabi網站，預測褐家鼠的ALDH4A1蛋白的二級結構。利用SWISSMODEL，預測蛋白的三級結構。

1.5 多序列比對對系統進化樹構建

利用UniProt在線數據庫blast功能，搜索與褐家鼠的ALDH4A1蛋白序列相似性較高的12種動物的ALDH4A1蛋白。使用MEGA7.0軟件構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 ALDH4A1蛋白的理化性質分析

褐家鼠的ALDH4A1蛋白是由563個，共20種氨基酸組成。各種氨基酸含量（見表1），其中，帶負電荷的氨基酸（Asp+Glu）有59個：Glu有 33個，Asp有26個。帶正電荷的氨基酸（Arg+His+Lys）有69個：Arg有30個，His 有10個，Lys 有29個，含量最高的是Ala（為10.3%），其次是Leu（為8.7%）。ALDH4 A1蛋白的分子量為61.869 kD，分子式 C2792H4330N754O806S16，等電點為7.13。該蛋白在哺乳動物細胞中的半衰期為30h，脂溶系數83.88，總體平均親水系數-0.154。其不穩定指數為41.65；消光系數為79340（mol/L）-1cm-1。

表1 褐家鼠ALDH4A1蛋白氨基酸的組成

2.2 ALDH4A1蛋白跨膜結構的預測

通過TMHMM預測的結果顯示，ALDH4A1蛋白沒有跨膜螺旋區（圖1），因此，不屬于跨膜蛋白。

圖1 褐家鼠ALDH4A1蛋白的跨膜結構預測

2.3 ALDH4A1蛋白親水或疏水性分析

親水或疏水性預測的結果顯示，殘基K461的親水性最強，其Score值為-2.644；F387的疏水性最強，其Score值為1.889；親水氨基酸的數量遠多于疏水氨基酸（圖2）。由此可知，褐家鼠ALDH4A1蛋白為親水性蛋白。

圖2 褐家鼠ALDH4A1蛋白親水/疏水性分析

2.4 ALDH4A1蛋白磷酸化位點的預測

磷酸位點預測的結果顯示，褐家鼠ALDH4A1蛋白共存在44個可能的磷酸化位點，其中，15個蘇氨酸磷酸化位點，24個絲氨酸磷酸化位點，5個酪氨酸磷酸化位點（見圖3）。

圖3 褐家鼠ALDH4A1蛋白的磷酸化位點

上述位點及其所對應的激酶（表2）。通常情況下，取閾值為0.5，磷酸化勢能越高，結果的置信度就會越高。當某個位點磷酸化的勢能遠大于0.5時，該位點是磷酸化位點的可能性就很大，反之，則可能性就較小。

表2 ALDH4A1蛋白磷酸化位點及對應激酶

2.5 ALDH4A1蛋白信號肽的預測

根據SIGNALP 4.0 SERVER網站的在線預測，ALDH4A1蛋白沒有信號肽的可能性為0.9975，有信號肽的可能性是0.0025。（圖4）。

圖4 褐家鼠ALDH4A1蛋白信號肽預測

2.6 ALDH4A1蛋白糖基化位點預測

2.6.1 N-糖基化位點預測

N-糖基化位點預測的結果顯示，ALDH4A1蛋白共有1個可能的N-糖基化位（圖5），是位于N210位的氨基酸。

圖5 褐家鼠ALDH4A1蛋白N-糖基化位點

2.6.2 O-糖基化位點預測

O-糖基化位點預測的結果顯示，ALDH4A1蛋白一共有7個可能的O-糖基化位點（圖6），分別為S75、S186、T191、T273、S324、S409及S551位的氨基酸。

圖6 褐家鼠ALDH4A1蛋白的O-糖基化位點

2.7 ALDH4A1蛋白二級結構

獲得ALDH4A1蛋白序列后，使用Prabi網站對 ALDH4A1蛋白質的二級結構進行預測。其中構成α-螺旋結構（Hh）的氨基酸有236個，占41.92%，構成延伸鏈結構（Ee）的氨基酸有84占14.92%，構成β-轉角結構（Tt）的氨基酸有28個，占4.97%，構成無規則卷曲結構（Cc）的氨基酸有215個，占38.19%（圖7）。

圖7 褐家鼠ALDH4A1蛋白二級結構

2.8 ALDH4A1蛋白三級結構

根據蛋白質三級結構建立網站構建ALDH4A1蛋白的三級結構，如圖8。

圖8 ALDH4A1蛋白三級結構的預測

2.9 ALDH4A1蛋白的相互作用網絡

蛋白質相互 作用的網絡分析顯示，ALDH4A1（圖9顯示為Iffo2）與10個蛋白之間都存在相互作用，分別是天冬氨酸轉氨酶（Got1），羥脯氨酸脫氫酶（Glul），谷氨酸脫氫酶1（Glud1），鳥氨酸轉氨 酶（Oat），脯氨酸脫氫酶（Prodh），羥脯氨酸脫氫酶（Prodh2），吡咯啉-5-羧酸還原酶1（Pycr1），吡咯啉-5-羧酸還原酶2（Pycr2），吡咯啉-5-羧酸還原酶3（Pycrl ）及δ-1-吡咯啉-5-羧酸合酶（ENSRNOG00000047305）（圖9）。

圖9 ALDH4A1蛋白-蛋白的相互作用網絡

2.10 ALDH4A1蛋白的同源性分析

用 UniProt 網站的 Blast 功能在線找到與褐家鼠ALDH4A1蛋白 氨基酸序列同源性較高的其他12種細菌，分別是小家鼠、黃金倉鼠、羊駝、小耳大嬰猴、北美灰熊、智人、馬鐵菊頭蝠、普通壁蜥、卡羅來納箱龜三趾亞種、綠頭鴨、青鳉和歐亞野豬。序列比對的結果顯示，ALDH4A1的氨基酸序列在動物之間保守性很高。與褐家鼠ALDH4A1序列一致性最高的是黃金倉鼠，高達91.7%；其次是小家鼠，序列一致性達91.5%；再次是小耳大嬰猴，序列一致性為90.2%；最低的是青鳉，為72.0%（圖 10）。

圖10 褐家鼠 與其他動物ALDH4A1蛋白多序列比對

2.11 ALDH4A1蛋白的進化分析

基于氨基酸序列的同源性分析，使用MEGA7.0對包括褐家鼠在內的13種動物的ALDH4A1蛋白進行多序列比，對并構建系統進化樹（圖11）。研究顯示，與褐家鼠親緣關系最近的是小家鼠和黃金倉鼠，小家鼠與黃金倉鼠聚為一支后，與褐家鼠聚為一支，置信度為76；其次是馬鐵菊頭蝠，但二者的置信度較低，僅為35。此外，羊駝和歐亞野豬聚為一支，置信度為73；普通壁蜥和卡羅萊納箱龜三趾亞種聚為一支，但它們都與褐家鼠親緣性較低。

圖11 基于AL DH4A1的氨基酸序列構建的褐家鼠與各動物系統進化樹

3 討論

心血管病（Cardiovascular disease,CVD）死亡占我國城鄉居民總死亡原因的首位，目前我國約有CVD患者人數約3.30 億[10]。CVD發病機制居高不下成為全球公共衛生問題，有關CVD治療和預防機制尚不明確。該研究利用生物信息學技術對ALDH4A1進行了分析。序列比對的結果顯示，ALDH4A1的氨基酸序列在動物之間保守性較。ALDH4A1氨基酸序列分析顯示，性質穩定、堿性的親水蛋白。TMHMM預測結果顯示，ALDH4A1蛋白無跨膜螺旋區，不存在信號肽，且具有潛在的糖基化和磷酸化修飾位點，以及蛋白激酶的結合位點。

由ALDH4A1蛋白二級結構預測的結果顯示，ALDH4A1蛋白主要以α-螺旋型結構和無規則的卷曲為主。由此可知，在ALDH4A1分子中，α-螺旋型結構利于蛋白質結構穩定，無規則的卷曲結構存在，可能與抗原表位的形成有關。蛋白質相互作用網絡分析顯示，ALDH4A1與Got1、Glul、Glud 1、Oat、Prodh、Pro dh2、等10個蛋白存在相互關系。研究表明，Got1[11]、Glul[12]等與炎癥反應高度相關，Prodh[13,14]可作為基因治療CVD的潛在靶點。炎癥反應是AS病理基礎[4,15]，在AS發生發展過程中發揮至關重要作用[7,16]，由此預測ALDH4A1與AS存在相互關系，進一步研究證AS小鼠和人類體內ALDH4A1表達水平顯著增加[9]。全面了解ALDH4A1 功能和機制有助于藥物設計，為AS治療提供靶向抗原，ALDH4A1也可以作為CVD潛在的治療方式之一。