阿司匹林干預(yù)腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)VEGF、bFGF 和YKL-40 成血管生長(zhǎng)因子

陳麗麗，王涵，武蕾蕾，展?jié)胤遥诮ú常瑓怯埃叩?/p>

（牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院 皮膚科，黑龍江 牡丹江 157011）

0 引言

腫瘤血管生成為腫瘤組織提供必需的營(yíng)養(yǎng)成分和氧氣，同時(shí)也是腫瘤組織擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的必要條件。靶向阻擊腫瘤血管生成一直是抗腫瘤轉(zhuǎn)移或抗腫瘤復(fù)發(fā)的熱點(diǎn)。但是，臨床研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用抗腫瘤血管生成類的藥物，卻沒有完全達(dá)到抗腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)期效果[1]。

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）包含腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞、炎癥細(xì)胞以及多種促血管生成因子等，這些成分構(gòu)成了腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的局部微環(huán)境，TME對(duì)腫瘤血管的生成起到重要的促進(jìn)作用[2]。血液中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，被炎癥因子募集到腫瘤組織中，經(jīng)細(xì)胞因子刺激極化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，該細(xì)胞能夠分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）、巨噬細(xì)胞源性腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）及白細(xì)胞介素-1（interleukin-1,IL-1）等細(xì)胞因子而促進(jìn)血管的生成[3]，并有助于腫瘤細(xì)胞擺脫免疫系統(tǒng)的攻擊，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，是血管生成因子的主要來源[4]。

膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤，具有新生血管較多并且雜亂的特點(diǎn)[5]。雖然目前以放化療或者手術(shù)治療為主，但是膠質(zhì)瘤具有易侵襲、轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，治療效果并不十分理想。證據(jù)表明高腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與腫瘤患者的疾病進(jìn)展和總生存率有關(guān)[6]。

研究發(fā)現(xiàn)：膠質(zhì)瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)，即膠質(zhì)瘤級(jí)別越高，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞越多[7]。又發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與微血管密度呈正相關(guān)，且級(jí)別越高越顯著[8]。目前關(guān)于膠質(zhì)瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的研究，多集中在膠質(zhì)瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡、侵襲和遷移方面的影響，而膠質(zhì)瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是否通過影響成血管因子的表達(dá)而調(diào)控膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移研究卻較少。

環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）對(duì)腫瘤血管的生成有促進(jìn)作用。阿司匹林具有選擇性抑制COX-2的重要作用[9]，在阿司匹林的干預(yù)下，是否可能影響膠質(zhì)瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌VEGF、bFGF以及YKL-40等成血管因子，是本課題所要解決的問題，研究結(jié)果將對(duì)揭示膠質(zhì)瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系探尋靶點(diǎn)，并為抗膠質(zhì)瘤做好研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人白血病THP-1單核細(xì)胞（購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）；人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U-87MG細(xì)胞（由沈陽(yáng)萬類生物科技公司惠贈(zèng)）。

1.1.2 主要試劑和儀器

RPMI-1640或DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），佛波酯（Phorbol ester，PMA；美國(guó)sigma公司），人重組白細(xì)胞介素-4蛋白（Interleukin-4，IL-4；美國(guó)BD公司），免抗人CD163（武漢博士得公司），免抗人VEGF單克隆抗體、免抗人FGF2單克隆抗體和山羊抗免IgG（美國(guó)Proteintech公司），超敏型二步法檢測(cè)試劑盒（北京中衫金橋公司），濃縮型DAB試劑盒（北京中衫金橋公司）。人VEGF、bFGF和YKL-40的ELISA試劑盒（美國(guó)R&D公司）。日本OLYMPUS倒置顯微鏡，西班牙Biological超凈工作臺(tái)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)THP-1細(xì)胞。含10%FBS的DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)U-87MG細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞誘導(dǎo)和分組

3×105/mL人白血病THP-1單核細(xì)胞，添加含PMA的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)24h后，更換含白細(xì)胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）的DMEM高糖完全培養(yǎng)基；37℃，5%CO2培養(yǎng)48h，誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞，單獨(dú)培養(yǎng)M2型巨噬細(xì)胞為M2組。單獨(dú)培養(yǎng)U-87MG細(xì)胞為U-87M組。U-87MG細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞非接觸共同培養(yǎng)為共培養(yǎng)M2組，共培養(yǎng)細(xì)胞用2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L阿司匹林進(jìn)行干預(yù)分別為2mM、4mM、8mM阿司匹林組。

1.2.3 非接觸共培養(yǎng)體系

3×105/mL人M2型巨噬細(xì)胞接種在孔徑0.4μm的Transwell培養(yǎng)板下室，DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。2×105/mL U-87MG細(xì)胞用DMEM高糖完全培養(yǎng)基重懸，接種至Transwell培養(yǎng)板上室；37℃，5%CO2培養(yǎng)12h后，待U-87MG細(xì)胞完全貼壁，Transwell培養(yǎng)板上室內(nèi)添加0mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L阿司匹林，37℃，5%CO2培養(yǎng)24h。

1.2.4 人M2 型巨噬細(xì)胞的鑒定

1×104THP-1細(xì)胞種植于附有玻片的24孔板內(nèi)，然后經(jīng)PMA和人重組IL-4誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞至貼壁并融合達(dá)70%以上；4%多聚甲醛固定30min；3%BSA工作液封閉，室溫放置20min；添加免抗人CD163抗體（1:200），4℃孵育過夜；0.01mmol/l PBS磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次3min；山羊抗免IgG（1:300），37℃孵育40min；0.01mmol/l PBS磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次2min；滴加DAB工作液，蘇木素輕度復(fù)染3min。顯微鏡觀察并照相。

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)VEGF、bFGF 的表達(dá)

取上述各組中單獨(dú)培養(yǎng)的細(xì)胞和共培養(yǎng)M2型巨噬細(xì)胞及阿司匹林作用的M2型巨噬細(xì)胞，經(jīng)固定、沖洗、封閉等處理后加入VEGF、bFGF一抗，4℃過夜；余步驟同M2型巨噬細(xì)胞的鑒定。

1.2.6 ELISA

3.5×104各組細(xì)胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)12h，提取各組細(xì)胞的上清液。使用人VEGF、bFGF地ELISA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞VEGF、bFGF的含量。

1.3 觀察指標(biāo)

需要與結(jié)果2.1,2.2,2.3對(duì)應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 THP-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

THP-1從血液中被募集到組織中，被細(xì)胞因子激活，轉(zhuǎn)化為TMAs。THP-1細(xì)胞經(jīng)2-3次傳代，狀態(tài)穩(wěn)定良好的情況下，細(xì)胞懸浮呈圓形，大小均勻，折光度較好。在培養(yǎng)液中添加含濃度為100ng/mL PMA的RPMI-1640完全培養(yǎng)基24h，細(xì)胞完全貼壁，形態(tài)由圓形轉(zhuǎn)變?yōu)槁褕A形或梭形有隆起。添加含濃度為20ng/mL IL-4的RPMI-1640完全培養(yǎng)基24h，部分細(xì)胞伸出偽足，形態(tài)變長(zhǎng)。48h后，細(xì)胞形態(tài)明顯改變，偽足延長(zhǎng)變細(xì)，圖1。

圖1 各組THP-1細(xì)胞培養(yǎng)24h的形態(tài)學(xué)特征（×100）

2.2 M2型巨噬細(xì)胞的表型鑒定

免疫組化結(jié)果表明：與THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)之前CD163表達(dá)（0.37%）相比，THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA及IL-4逐級(jí)誘導(dǎo)后出現(xiàn)高表達(dá)的M2型巨噬細(xì)胞特異性抗原CD163（93.7%），兩組數(shù)據(jù)相比具有顯著差異（P<0.01），圖2。

圖2 THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA及IL-4誘導(dǎo)后CD163的表達(dá)（×400）

2.3 ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞VEGF、bFGF和YKL-40含量

單獨(dú)培養(yǎng)的M2型巨噬細(xì)胞及與U87MG細(xì)胞共同培養(yǎng)的M2型巨噬細(xì)胞均見VEGF，bFGF和YKL-40的表達(dá)，但共培養(yǎng)的M2型巨噬細(xì)胞VEGF，bFGF和YKL-40表達(dá)明顯增多，數(shù)據(jù)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義（P<0.01）。與共同培養(yǎng)的M2型巨噬細(xì)胞相比較，當(dāng)在共培養(yǎng)體系中加入2mm、4mm、8mm不同濃度阿司匹林后，阿司匹林組VEGF，bFGF和YKL-40含量逐漸降低，數(shù)據(jù)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義（P<0.01）。當(dāng)阿司匹林濃度達(dá)8mm時(shí)，共培養(yǎng)體系M2型巨噬細(xì)胞VEGF，bFGF和YKL-40含量較2mm和4mm阿司匹林干預(yù)的M2型巨噬細(xì)胞明顯最低，數(shù)據(jù)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義（P<0.01），表1。

表1 ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞VEGF、bFGF含量（，n=16，pg/mL）

表1 ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞VEGF、bFGF含量（，n=16，pg/mL）

注：*P<0.01，與U-87M組和M2組比較；#P<0.01，與共培養(yǎng)M2組比較

3 討論

膠質(zhì)瘤是一種頑固、常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤，具有新生血管較多并且雜亂的特點(diǎn)[5]。臨床目前主要進(jìn)行放化療或者手術(shù)治療，但膠質(zhì)瘤具有易侵襲、轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，導(dǎo)致以上治療效果一直不理想，因此我們需要不斷地尋找新的治療方法，為臨床治療膠質(zhì)瘤提供新思路。

在腫瘤組織中可以發(fā)現(xiàn)各種免疫細(xì)胞。血液中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，被炎癥因子募集到腫瘤組織中，經(jīng)細(xì)胞因子刺激極化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）。從功能表型上，巨噬細(xì)胞大致分為：經(jīng)典（M1）型和替代（M2）型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞能夠被γ-干擾素等誘導(dǎo)，主要抗感染，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。M2型巨噬細(xì)胞分泌多種因子，有助于腫瘤細(xì)胞擺脫免疫系統(tǒng)的攻擊，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞經(jīng)腫瘤誘導(dǎo)更接近TAMs。有資料顯示：TAMs在腫瘤微環(huán)境中扮演重要角色，TAMs是血管生成因子的主要來源[10]，如M2型巨噬細(xì)胞可以釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）等直接促進(jìn)血管的生成[3]，還可以釋放巨噬細(xì)胞源性腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）及白細(xì)胞介素-1（Interleukin-1,IL-1）等促進(jìn)黑色素瘤中白細(xì)胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）和VEGF的釋放，從而間接促進(jìn)腫瘤的血管生成[11]。越來越多的證據(jù)表明高TAMs浸潤(rùn)與腫瘤患者的疾病進(jìn)展和總生存率有關(guān)。

VEGF和bFGF是最常見的成血管因子，其促進(jìn)血管形成的機(jī)制已有大量報(bào)道，如它們可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，也可以動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移并摻入到成熟內(nèi)皮細(xì)胞中而發(fā)揮促血管生成作用[12]。YKL-40是一種分泌型糖蛋白，通常由多種細(xì)胞如巨噬細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)[13]。大量證據(jù)表明YKL-40不僅是急性及慢性炎癥標(biāo)志物，而且參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、血管生成及組織重構(gòu)等過程[14]。

阿司匹林是經(jīng)典的非甾體抗炎藥，具有選擇性抑制環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）的作用。已有研究表明COX-2對(duì)腫瘤血管的生成有促進(jìn)作用。COX-2對(duì)腫瘤血管形成的機(jī)制為：①促進(jìn)血管內(nèi)皮類生長(zhǎng)因子的表達(dá)如VEGF；②前列腺素類產(chǎn)物如血栓素A2、前列腺素E2、前列環(huán)素能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及血管形成；③通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)或Akt基因的活性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成。Kale和Gan的研究證實(shí)：M2型巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生COX-2。那么，在阿司匹林的干預(yù)下，是否可能通過抑制COX-2來影響TAMs成血管因子VEGF、bFGF以及YKL-40的表達(dá)呢？這也是本課題所要解決的問題。

鑒于以上原因，實(shí)驗(yàn)中我們采用共培養(yǎng)系統(tǒng)首先設(shè)計(jì)了常見的VEGF、bFGF以及YKL-40影響血管形成因子研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與單獨(dú)培養(yǎng)的M2型巨噬細(xì)胞比，同U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌VEGF、bFGF以及YKL-40明顯增加。結(jié)果顯示：與U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的M2型巨噬細(xì)胞可以高表且與單獨(dú)培養(yǎng)的M2型巨噬細(xì)胞比具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上這些成血管因子的變化說明膠質(zhì)瘤細(xì)胞可能參與誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞大量表達(dá)和分泌VEGF、bFGF以及YKL-40，但具體的機(jī)制還不清楚。當(dāng)阿司匹林濃度達(dá)8mm時(shí)，共培養(yǎng)體系中的M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)VEGF較空白對(duì)照組的M2型巨噬細(xì)胞明顯減少。因此，如果采用阿司匹林可以起到重要的抗血管新生作用，阿司匹林不但可以直接抑制腫瘤細(xì)胞成血管因子的表達(dá)，同時(shí)也可以對(duì)腫瘤微環(huán)境中M2型巨噬細(xì)胞成血管因子的生成起到抑制作用，從而為腫瘤的抗血管治療提供更多可靠依據(jù)，也可為阿司匹林的進(jìn)一步藥用價(jià)值開發(fā)帶來新希望。

這項(xiàng)研究初步探索了阿司匹林干預(yù)腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)VEGF、bFGF和YKL-40成血管生長(zhǎng)因子的影響，關(guān)于阿司匹林干預(yù)血管新生的靶點(diǎn)機(jī)制研究還需要借助基因組學(xué)、代謝組學(xué)等手段深入探索。