冰溫貯藏甘南藏羊肉色穩定性與線粒體MMb還原能力研究

師希雄 張攀高 趙瑞娜 包曉明 范小寧

(甘肅農業大學食品科學與工程學院， 蘭州 730070)

0 引言

藏羊可適應海拔3 000 m以上的高寒缺氧環境[1]，其中，甘南藏羊包括歐拉型、喬科型與甘加型[2]。歐拉型藏羊產肉性能良好，且形成了風味獨特的羊肉產品[3]。歐拉型藏羊肉在貯藏期間肉色不穩定，極易發生劣變。因此，有必要研究藏羊肉貯藏期間肉色穩定性的調控。

影響肉色穩定性的因素有內在因素和外在因素：內在因素包括肉的pH值、高鐵肌紅蛋白還原酶活性(Metmyoglobin-reducing activity，MRA)等；外在因素有溫度、光照、氧氣、微生物等[4]。高鐵肌紅蛋白還原酶使肌紅蛋白處于還原狀態，一旦形成高鐵肌紅蛋白，將使之還原，延長肉的貨架期。冰溫指凍結點以上，0℃以下的溫度[5]。冰溫貯藏可通過調控高鐵肌紅蛋白還原酶系統從而影響肉色的穩定。文獻[4]報道，冰溫條件下，大尾寒羊與小尾寒羊雜交公羊的肉色穩定性與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamnide adenine dinucleotide，NADH)濃度、MRA有關。目前，冰溫貯藏對畜禽肉、魚肉及蝦肉等品質的影響已有研究報道[6-12]。

然而，由于品種、生活習性與地域的差異，藏羊與普通羊肉的肉品質、生理生化特性存在差異[13]，這些可能會影響貯藏過程中品質的變化。對于冰溫貯藏中線粒體高鐵肌紅蛋白(Metmyoglobin，MMb)還原能力與藏羊肉色穩定性關系尚未見報道。

參考文獻[14]的方法，本文預試驗測定藏羊肉的冰點溫度為-1.5℃，考慮到設備溫度±0.1℃波動，本文確定-1.4℃作為藏羊肉冰溫貯藏溫度。本研究以甘南藏羊后腿肉為試驗材料，在冰溫((-1.4±0.1)℃)與冷藏((4±1)℃)兩種條件下分別貯藏，測定貯藏期間(0、1、3、5、7、9 d)MRA、NADH含量、琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase，SDH)活力、線粒體膜通透性、線粒體膜電位與肉色色調角的變化，研究冰溫貯藏甘南藏羊肉色穩定性與線粒體MMb還原能力的關系，從而為改善肉色提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1試驗原料及樣品處理

選取3歲去勢甘南藏羊后腿肉宰后0.5 h肉樣，一部分樣品現場測定肉色指標后液氮速凍，用于測定“0 d”其他指標，剩余肉樣除去脂肪與筋膜，之后，隨機分為冰溫組和冷藏組(取一份肉樣進行冰點的測定，冷藏組為對照)，用保鮮膜包裹后在-18℃冰箱降溫，冷藏組與冰溫組樣品的中心溫度分別達到4℃及0℃時取出，分別放入冷藏庫((4±1)℃)和恒溫恒濕試驗箱((-1.4±0.1)℃)，在貯藏1、3、5、7、9 d取出冰溫組與冷藏組肉樣，現場測定色度，其余樣品在-80℃保存，測定其余指標。

1.1.2試驗儀器與試劑

試驗儀器：恒溫恒濕試驗箱(QL-HWHS-100L型)，合肥安科環境試驗設備有限公司；色度計(Konica CR-10型)，柯尼美能達光電股份有限公司； pH計(PHS-3C型)，上海寧隆儀器有限公司；紫外-可見分光光度計(UV-2550型)，島津上海有限公司；高速冷凍離心機(TGL-24MC型)，湖南平凡科技有限公司；熒光分光光度計(RF 5301-PC型)，日本島津公司；酶標儀(Spectramax M2型)，美國美谷分子儀器有限公司。

試驗試劑：肌紅蛋白、Tris-HCl、Hepes、蔗糖、甘露醇，以上試劑均為分析純。

線粒體的提取、膜電位測定(JC-1)及SDH活力檢測所用的試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1MRA測定

參考文獻[15]制備反應物。將MMb配制成0.75 mmol/L溶液；標準反應混合物由5.0 mmol/L乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、3.0 mmol/L K4Fe(CN)6、2.0 mmol/L NADH、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)組成。

參考文獻[15]的方法稍作修改制備高鐵肌紅蛋白還原酶。取肉樣10 g加入20 mL冰預冷的磷酸鹽緩沖液(2.0 mmol/L，pH值7.0)，在冰浴條件下均質1 min。均質液在4℃條件下離心(10 000 r/min，20 min)，上清液過濾除去脂肪。將濾液中的氧合肌紅蛋白用稍過量的高鐵氰化鉀氧化后，用上述緩沖液在4℃條件下透析1 d，之后，在4℃條件下離心(12 000 r/min，20 min)，用磷酸鹽緩沖液將上清液定容至20 mL，即為粗酶液。

MRA測定參考文獻[16]的方法并修改，取一定量的肌肉提取液加入到標準反應混合物中，在580 nm波長處測定MbO2和MMb的吸光度，MRA用反應線性階段每克肉具有的活力單位(U/g)表征。

1.2.2NADH含量測定

參考文獻[17]，根據試劑盒說明書進行操作。稱取0.1 g肉樣中加入0.5 mL堿性提取液，冰浴研磨，煮沸5 min，冰浴冷卻后，4℃條件下離心(10 000g，10 min)，取上清200 μL，加入等體積酸性提取液混勻，4℃條件下離心(10 000g，10 min)，取上清，然后測定。

1.2.3線粒體提取

按照試劑盒說明書進行。取肉樣0.2 g，加入冰預冷的Lysis Buffer 1.0 mL，在冰浴條件進行20次研磨，隨后4℃、1 000g離心5 min，重復1次。取上清，離心10 min(4℃，12 000g)，棄上清，沉淀中加入Wash Buffer 0.5 mL重新懸浮線粒體沉淀，離心(4℃、1 000g)5 min，取上清，離心(4℃、12 000g)10 min，棄上清，線粒體沉淀在管底，用0.1 mL Store Buffer重新懸浮沉淀，-80℃保存待用。

1.2.4線粒體膜通透性測定

參考文獻[18]的方法并做修改。取肉樣3 g，加入30 mL分離液(250 mmol/L蔗糖，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH值7.4)，勻漿后離心15 min(4℃，1 500g)，將上清液離心20 min(4℃，12 000g)，用分離液洗滌沉淀兩次后溶于緩沖液(250 mmol/L蔗糖，10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.4)中，即得到線粒體懸浮液，測定蛋白濃度并稀釋。取0.3 mL稀釋溶液加入到2.7 mL測試溶液(230 mmol/L甘露醇，70 mmol/L 蔗糖，3 mmol/L Hepes，pH值7.4)中，25℃水浴3 min后，于540 nm處測吸光度。另外，以3 mL測試溶液作為對照。

1.2.5線粒體膜電位測定

按照試劑盒說明書進行測定。線粒體蛋白(0.1 mg/mL)與9倍體積的JC-1染色工作液混合。在490 nm的激發波長、530 nm的發射波長和525 nm的激發波長、590 nm的發射波長條件下測定溶液單體熒光值和聚集態熒光值。單體熒光值與聚集態熒光值的比值即為線粒體膜電位。

1.2.6SDH活力測定

根據試劑盒說明書測定。在0.5 g肉樣中加入0.86%的生理鹽水4.5 mL，冰浴勻漿后在4℃、1 000g條件下離心10 min，取上清測定。

1.2.7色調角測定

參考文獻[19]的方法，采用色差儀測定樣品的a*、b*值，運用arctan(b*/a*)計算色調角[20]。

1.3 數據處理

用SPSS 19.0軟件做方差分析、相關性分析，多重比較采用Duncan法，Origin 9.0軟件繪制圖形，所有的指標測定3次，試驗結果以“平均數±標準差”來表示。

2 結果與分析

2.1 MRA

MRA是肉色保持穩定的主要影響因素[21]。從圖1(大寫字母表示組內差異顯著，小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，下同)可知，隨著時間的延長，冰溫組和冷藏組MRA均呈逐漸下降的趨勢。冰溫組在貯藏3、5、7、9 d時，MRA顯著高于冷藏組(P<0.05)，9 d時，冰溫組的MRA比冷藏組高16.67%(P<0.05)。由此可見，冰溫貯藏延緩了藏羊肉MRA的下降。這可能是由于溫度對高鐵肌紅蛋白還原酶活性的影響[22]。該結果與文獻[4]報道的冰溫對高鐵肌紅蛋白還原活性影響的結果相似。

圖1 冰溫貯藏對藏羊肉MRA的影響Fig.1 Effects of controlled freezing point storage on MRA in Tibetan sheep meat

2.2 NADH含量

線粒體外膜NADH依賴型的MMb還原酶的酶促還原反應是線粒體將MMb還原的途徑之一[23]。在糖酵解和細胞呼吸作用的檸檬酸循環中產生NADH，NADH是輔酶，作為電子供體在MMb還原過程中發揮作用[17]。從圖2可知，隨著時間的增加，冰溫組和冷藏組NADH含量均呈逐漸下降的趨勢。在第9天時，冰溫組NADH含量(質量摩爾濃度)比冷藏組高33.16%(P<0.05)。由此可見，冰溫貯藏可延緩NADH含量的下降，可能由于冰溫貯藏延緩了藏羊肉骨骼肌呼吸功能的破壞[24]。

圖2 冰溫貯藏對藏羊肉NADH含量的影響Fig.2 Effects of controlled freezing point storage on NADH content in Tibetan sheep meat

2.3 線粒體膜通透性

線粒體膜的通透性指數常用540 nm處吸光度表示，其越小，表示透過線粒體膜的光越多，線粒體膜通透性越大[18]。從圖3可知，在冰溫和冷藏貯藏條件下吸光度隨著貯藏時間的延長而逐漸下降，表明了線粒體膜的通透性不斷增加。在第9天時，冰溫組的吸光度比冷藏組高25.45%(P<0.01)。由此表明，冰溫貯藏可延緩線粒體膜通透性的增大，這可能由于冰溫貯藏延緩了線粒體結構的損傷[24]。

圖3 冰溫貯藏對藏羊肉線粒體膜通透性的影響Fig.3 Effects of controlled freezing point storage on mitochondrial membrane permeability in Tibetan sheep meat

2.4 線粒體膜電位

線粒體膜通透性與線粒體膜電位的變化是線粒體膜損傷的標志[18]。由圖4可見，在冰溫和冷藏兩種貯藏條件下，線粒體膜電位隨著時間的增加而下降。在第9天時，冰溫組藏羊肉線粒體膜電位比冷藏組高16.57%(P<0.05)。由此可見，冰溫貯藏可延緩藏羊肉貯藏過程中線粒體膜電位的下降，這可能是由于冰溫抑制了線粒體膜的改變。

圖4 冰溫貯藏對藏羊肉線粒體膜電位的影響Fig.4 Effects of controlled freezing point storage on mitochondrial membrane potential in Tibetan sheep meat

2.5 SDH活力

SDH是線粒體的標志酶，它的活性能反映線粒體的功能[25]。從圖5可知，在冰溫和冷藏兩種貯藏條件下SDH活力隨宰后貯藏時間的延長而顯著降低。在第9天時，冰溫組SDH活力顯著高于冷藏組(P<0.05)，比冷藏組高40.45%(P<0.05)。由此可見，冰溫可延緩SDH活力的下降，這可能是由于低溫延緩了酶活性的降低。

圖5 冰溫貯藏對藏羊肉SDH活力的影響Fig.5 Effects of controlled freezing point storage on SDH activity in Tibetan sheep meat

圖6 冰溫貯藏對藏羊肉色調角的影響Fig.6 Effects of controlled freezing point storage on Hue angle in Tibetan sheep meat

2.6 色調角

色調角代表褪色程度，其值越大，表明褪色速率越快[26]。由圖6可看出，冷藏組與冰溫組的色調角總體呈現先上升后穩定的趨勢。在第9天時，冰溫組色調角比冷藏組低13.13%(P<0.01)。本研究表明，冰溫貯藏可延緩色調角的上升，可能是由于冰溫延緩了MMb的形成，因而有利于保持肉色穩定[27]。

2.7 線粒體高鐵肌紅蛋白還原能力與肉色穩定性的相關性

由表1可知，冰溫組、冷藏組MRA、NADH含量、線粒體膜540 nm處吸光度、線粒體膜電位、SDH活力均與色調角呈極顯著負相關(P<0.01)。由此可見，MRA、NADH含量越高，線粒體結構損傷程度越小，MMb還原能力越強，色調角越低，肉的顏色越穩定。MMb還原酶是高鐵肌紅蛋白酶促還原反應的關鍵酶，在NADH存在的條件下，它可將高鐵肌紅蛋白還原[28]。而且，畜禽宰后貯藏受損的線粒體結構會導致肉色穩定性顯著降低[21]。因此，MRA、NADH含量越高，線粒體結構損傷程度越小，肉色越穩定。本試驗結果與文獻[4]報道的冰溫貯藏通過影響大尾寒羊與小尾寒羊雜交公羊肉高鐵肌紅蛋白還原酶活性及NADH濃度調控肉色穩定的結果相似。

3 結束語

貯藏9 d時，冰溫組MRA、NADH含量、線粒體膜的通透性指數、線粒體膜電位和SDH活力分別比冷藏組高16.67%、33.16%、25.45%、16.57%和40.45%。色調角比冷藏組低13.13%。因此，冰溫貯藏延緩了藏羊肉MRA、NADH含量、線粒體膜540 nm處吸光度、線粒體膜電位和SDH活力的降低，色調角的升高，有利于維持線粒體高鐵肌紅蛋白還原能力，延緩線粒體結構的損傷，進而維持藏羊肉色的穩定。

表1 冰溫與冷藏兩種條件貯藏過程中各指標間的相關性Tab.1 Correlation coefficients of various indicators under controlled freezing point storage and cold storage