金雀異黃素對人晶狀體上皮細胞氧化損傷的保護作用機制

馮春燕 唐宋文 黃秀榕▲ 祁明信 胡艷紅

1.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院眼科，福建福州 350003；2.福建中醫藥大學，福建福州 350003

研究發現雌激素對晶狀體有保護作用，可減輕晶狀體氧化損傷、抑制晶狀體上皮細胞（lens epithelial cell，LEC）凋亡，起到防治白內障的作用[1-6]。 富含植物雌激素的中藥，如補骨脂、牛膝、葛根等具有雌激素樣活性[7]，在抗癌、預防心腦血管疾病等方面，具有雌激素不可替代的很多優點。金雀異黃素（genistein，GEN）又名染料木黃酮，是一種來源于豆類植物的異黃酮類化合物，其化學名為5，4，7-三羥基異黃酮。 它是有芳香環的三苯基異黃酮化合物，帶有兩個酚羥基的結構類似于雌二醇（β-estradiol，E2），分子量為270，能低親合力地結合雌激素受體（estrogen receptor，ER），具有微弱雌激素樣作用，其生物效應相當于E2的10-5～10-3，故有植物雌激素之稱[8]。

課題組前期工作發現GEN 能夠保護實驗性人晶狀體上皮細胞系（human lens epithelial cell B3，HLEB3）氧化損傷和減輕細胞凋亡程度[9-11]。本研究擬在探討具有雌激素活性的中藥單體GEN 防護HLE-B3 氧化損傷的基礎上，采用表面增強激光解析離子化飛行時間質譜（surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）聯合蛋白質芯片技術檢測分析GEN 作用于氧化損傷的HLE-B3 后線粒體蛋白質表達譜的改變，尋求其防護HLE-B3 氧化損傷的線粒體蛋白質組學規律及作用靶點，為臨床尋求防治老年性白內障的安全有效天然藥物提供科學的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

HLE-B3 細胞由廣州中山大學眼科研究中心提供；E2粉末（Sigma，美國，純度97%），GEN 粉末（國家藥品生物制品檢定所，中國，純度96.3%），30%過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2，上海試劑總廠，中國），DMEM 培養基（DMEM，GIBCO，美國），線粒體分離試劑盒（試劑A 和試劑C，Pierce，USA）和線粒體蛋白質分離試劑盒（星漢生物科技有限公司，中國）。 自動酶標讀數儀（BioTek ELX808，美國）；PBS Ⅱ+型SELDITOF-MS 及Bio-processor 96 孔蛋白質芯片工作平臺（美國）；Biophotometer 6131 蛋白核酸測定儀 （德國）；常溫離心機（Heraeus Inc.，德國）；低溫離心機（Beckman Coulter Avanti J-20，德國）。

1.2 方法

1.2.1 HLE-B3 培養及傳代 ①將凍存細胞的凍存管立即放入37℃水中解凍，將細胞懸浮液在培養基中稀釋10 倍，離心半徑10 cm，以1000 r/min 離心5 min，去上清，然后磷酸鹽緩沖液洗滌3 次。 ②以5×105個/ml細胞接種于培養瓶中， 并在37℃、5%CO2培養箱培養。 ③待2～3 d 細胞生長融合后進行傳代培養。

1.2.2 分組 將HLE-B3 分為四組，正常組、H2O2組、E2組 和GEN 組。 正常組：HLE-B3+DMEM 培 養液；H2O2組：HLE-B3+DMEM 培養液+H2O2（終濃度300 μmol/L）；E2組：HLE-B3+DMEM 培養液+H2O2（終濃度300 μmol /L）+E2（終濃度×10-8mol/L）；GEN組：HLE-B3+DMEM 培養液+H2O2（終濃度300 μmol/L）+GEN（終濃度×10-6mol/L）。

1.2.3 SELDI-TOF-MS 聯合蛋白質芯片技術檢測HLE-B3 線粒體蛋白質組的變化 ①收集2×107個細胞于2.0 ml 微量離心管A，離心半徑15 cm，2259 r/min，2 min，棄上清；②加800 μl 線粒體分離試劑A 于離心管A，漩渦5 s，冰上孵育2 min；③細胞懸液轉于冰冷的杜恩斯組織研磨器充分勻漿細胞，然后勻漿液移到原離心管A 中，加800 μl 線粒體分離試劑C 和200 μl線粒體分離試劑A，混勻，離心半徑15 cm，2050 r/min，10 min，4℃；轉上清液于離心管B，離心半徑15 cm，4244 r/min，15 min，4℃；轉上清液于離心管C，加500 μl線粒體分離試劑C，離心半徑15 cm，8490 r/min，5 min，4℃，棄上清，所得沉淀即為HLE-B3 線粒體。 ④加200 μl 線粒體蛋白質提取試劑，4℃振蕩15 min，混合，離心半徑15 cm，8490 r/min，15 min，4℃。 提取上清液后，測定蛋白質濃度，調整為5 mg/ml。 ⑤每個線粒體蛋白樣品與CM10 芯片組合，每個處理組的芯片上有3 個點。向每個樣品點加入結合緩沖液（50 mmol/L乙酸鈉，pH 值4.0，3 μl），浸泡3 次，每次5 min。 取出緩沖液，立即加入5 μl 緩沖液，將蛋白質樣品稀釋至1.8 mg/ml。 在室溫下1 h 后，除去緩沖液，每個斑點加入3 μl 結合緩沖液，5 min 后除去，該過程重復3 次。將HPLC 級水（3 μl）加入每個斑點，然后立即除去，該程序重復2 次。 ⑥芯片風干20 min，加入能量吸收分子SPA 溶液，然后空氣干燥，采用統一分析參數，激光強度設置為185， 檢測靈敏度為7， 檢測上限為100 000 質荷比，優化采集數據范圍為2000～20 000 m/z，信號采集位置為20～80，每個樣本平均有144 個點。

1.3 數據處理與統計分析

使用Proteinchip 軟件3.2 以xlm 格式導出初始數據。SELDI-TOF-MS 數據以為均數±標準差（±s）表示。 浙江大學癌癥研究所設計的ZUCI-Protein Chip數據分析系統進行統計分析。通過統計過濾結合模型依賴性篩選的方法選取特征向量。 通過Kruskal-Wallis 秩和檢驗分析每個質荷比。 通過Nemenyi 檢驗對四組中質荷比的蛋白質峰值進行兩兩比較，以P＜0.05 為有統計學意義[12]。

2 結果

2.1 H2O2 對HLE-B3 線粒體蛋白質組的影響

經H2O2作用的HLE-B3 在CM10 芯片結合的蛋白點有50 個， 其中質荷比為6532 和6809 的2 個蛋白點的峰值高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1、圖1～2）。

表1 H2O2 對HLE-B3 線粒體蛋白質組的影響（n=3，±s）

表1 H2O2 對HLE-B3 線粒體蛋白質組的影響（n=3，±s）

6532 6809 107.76±70.84 109.59±31.19 1460.72±267.57 522.09±200.20+13.6+4.8質荷比 峰值改變倍數平均峰值正常組 H2O2 組

2.2 E2 對H2O2 誘導氧化損傷的HLE-B3 線粒體蛋白質組的影響

經E2作用于H2O2誘導氧化損傷的HLE-B3 在CM10 芯片結合的蛋白點有46 個，其中質荷比為6532的蛋白點的峰值（519.59±138.72）低于H2O2組的（1460.72±267.57），為H2O2組的2.8 倍，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

2.3 GEN 對H2O2 誘導氧化損傷的HLE-B3 線粒體蛋白質組的影響

經GEN 作用于H2O2誘導氧化損傷的HLE-B3在CM10 芯片結合的蛋白點有49 個，其中質荷比為6532 和6809 這2 個蛋白點的峰值低于H2O2組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2、圖4～5）。

表2 GEN 對H2O2 誘導氧化損傷的HLE-B3 線粒體蛋白質組的影響（n=3，±s）

表2 GEN 對H2O2 誘導氧化損傷的HLE-B3 線粒體蛋白質組的影響（n=3，±s）

6532 6809 1460.72±267.57 522.09±200.20 420.22±449.56 109.98±59.92-7.6-4.7質荷比 峰值改變倍數平均峰值H2O2 組 GEN 組

3 討論

Nordgaard[13]從人眼庫的眼球中分離出視網膜色素上皮細胞的線粒體蛋白質，經雙向電泳，質譜分析，發現年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD) 較正常組有八個差異表達蛋白位點，提示AMD 的發生與線粒體功能障礙有關。 Saraswathy等[14]發現視網膜線粒體蛋白水平在實驗性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveoretinitis，EAU）早期階段對氧化應激的反應。

課題組前期研究發現：GEN 可提高由H2O2誘導氧化損傷的HLE-B3 內超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低膜脂質過氧化產物丙二醛（malonaldehyde，MDA）的含量，以及升高線粒體膜電位，表明GEN 發揮了雌激素樣作用，能夠保護實驗性HLE-B3 氧化損傷和減輕細胞凋亡程度[11-13]。

本實驗H2O2組檢測到的蛋白點有50 個，E2組檢測到的蛋白點有46 個，GEN 組檢測到的蛋白點有49個。其中，用H2O2誘導HLE-B3 氧化損傷后，出現質荷比為6532 和6809 兩個差異的蛋白點表達均上調；E2作用于氧化損傷的HLE-B3 后， 出現質荷比為6532 蛋白點表達下調；GEN 作用于氧化損傷的HLE-B3 后，出現質荷比為6532 和6809 兩個蛋白點表達下調。說明GEN 在防護由H2O2所致HLE-B3 氧化損傷的同時，也引起HLE-B3 線粒體差異蛋白的表達，質荷比為6532 的蛋白點可能是GEN 防護H2O2誘導的HLE-B3 氧化損傷的重要的作用靶點。 質荷比為6532的蛋白點在Swiss-Prot 數據庫中檢索的匹配蛋白質，明確與人晶狀體上皮細胞凋亡、細胞氧化損傷和老年性白內障相關的蛋白質只有一種，即40S 核糖體蛋白S29（ribosomal protein S29，RPS29）。

線粒體核糖體蛋白（mitochondrial ribosomal pro teins，MRPs）是線粒體核糖體（mitochondrial ribosome）的重要組成部分，其中任何一種發生突變或缺失也會影響到線粒體蛋白的合成而導致線粒體疾病。MRPs 有兩個亞基：大亞基MRPL（60S）和小亞基MRPS（40S）[15]。 Zhang 等[16]發現編碼MRPL21、L15、L13a 和L7a 的基因的表達在老年性白內障患者晶狀體中表達均較正常晶狀體中下降，結果表明核糖體蛋白調節細胞蛋白合成和（或）介導細胞其他功能和老年性白內障的發生密切相關。

線粒體核糖體蛋白S29（mitochondrial ribosomal protein S29，MRPS29）是線粒體核糖體小亞基的一種40S 蛋白組分。 MRPs 除了構成線粒體的翻譯機器之外，還具有其他的功能。 1996年，Kondoh 等[17]首次發現RPS29 能增加Krev-1 基因表達產物對惡性增殖細胞的抑制活性；Khanna 等[18]研究表明RPS29 在細胞凋亡發生過程中發揮著首要的關鍵作用。 唐勝建等[19]實驗研究發現RPS29 基因表達產物也能抑制成纖維細胞的增殖， 并能促進成纖維細胞凋亡的發生。Cavdar Koc 等[20]研究發現與細胞凋亡密切相關的兩種蛋白GTP 結合蛋白DAP3 和PDCD9 實際上是線粒體核糖體小亞基組成蛋白MRPS29 和MRPS30，進一步明確了線粒體核糖體與細胞凋亡有密切關系。Han等[21]EST 數據庫的網絡搜索揭示了在5′-UTR 處含有上游開放閱讀框（Upstream Open Reading Frame，uORF）的MRPS29mRNA 的剪接變體的存在。 此研究中提供的數據表明MRPS29 表達受損，這是由于在熒光素酶測定和蛋白質印跡分析中顯示的MRPS29 mRNA 的5′-UTR 中發現的uORF。 通過siRNA 處理減少內源性MRPS29 表達阻止HeLa 和CHO 細胞經歷STS 誘導的線粒體片段化和凋亡。 進一步證實線MRPS29 是線粒體促凋亡蛋白，也稱為死亡相關蛋白3（death associated protein 3，DAP3）。

本研究發現，H2O2誘導HLEC 氧化損傷的同時，也引起HLEC 內線粒體RPS29 表達的增加， 影響HLEC 線粒體蛋白合成，導致HLEC 氧化損傷和HLEC凋亡。植物雌激素GEN 能下調HLEC 內線粒體RPS29表達，抑制HLEC 凋亡，保護HLEC 氧化損傷。 因此，GEN 能有效防護H2O2誘導的HLE-B3 氧化損傷，質荷比為6532 的蛋白點可能是GEN 防護H2O2誘導的HLE-B3 氧化損傷的作用靶點，線粒體RPS29 可能是植物雌激素GEN 保護HLEC 氧化損傷的一個線粒體蛋白質。 本研究發現的植物雌激素GEN 在保護氧化損傷的HLEC 的過程中差異表達的線粒體蛋白質組作用靶點和線粒體蛋白質等線粒體蛋白質組學機制，將為進一步闡明老年性白內障的發病機制，尋求防治老年性白內障安全有效天然藥物提供新的有價值的線索和科學的實驗依據。