基于網絡藥理學和代謝組學的苦參烏梅湯對HepG 2.2.15 細胞模型抗乙型肝炎病毒作用機制研究

鄭 蕊 郭 朋 劉 宇 孔 偉 陳 艷

中國中醫科學院西苑醫院藥學部，北京 100091

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）在世界范圍內廣泛流行。持續感染HBV 可引起肝硬化、肝功能衰竭甚至誘發肝癌[1]。據世界衛生組織報道的數據顯示，截至2015 年，全球約有2.57 億人感染HBV[2]。我國屬于HBV 中度流行區[3]。目前，我國共有HBV 感染者約8600 萬例，人群感染HBV 流行率為5%～6%[4]。鑒于HBV 攜帶者人群規模較大，開發一種有效抗HBV 藥物迫在眉睫。

我國傳統中醫藥為開發有效抗HBV 藥物提供了一個重要途徑。中國中醫科學院西苑醫院肝病科在前輩岳美中、關茂會、尚爾壽等老先生長期治療慢性乙型肝炎經驗總結的基礎上，用苦參烏梅湯抗HBV 取得了良好的臨床療效。苦參烏梅湯由苦參、烏梅兩味中藥組成，多年臨床實踐證實，疏肝健脾治法加用苦參烏梅湯清熱利濕養陰，對乙型肝炎患者HBV 標志物乙型肝炎E 抗原（Hepatitis Be antigen，HBeAg）、乙型肝炎病毒基因（Hepatitis B virus gene，HBVDNA）具有顯著的干預作用[5]。課題組前期工作研究發現，苦參烏梅湯能夠顯著抑制HBV 轉基因小鼠血清中乙型肝炎表面抗原（Hepatitis Bs antigen，HBsAg）的表達[6-7]；體外細胞實驗顯示，其能抑制HepG 2.2.15 細胞HBsAg、HBeAg 的分泌和HBVDNA的復制[8]。盡管苦參烏梅湯抗HBV 的療效確切，但尚缺乏其藥效作用機制方面的系統研究。

中藥及其復方成分復雜，常通過多途徑、多靶點協同發揮治療作用，傳統的中藥作用機制研究可以整體分析有效成分、生物靶標及代謝物之間的相互作用。網絡藥理學是在系統生物學理論指導下衍生出的以藥物多成分、多靶點為切入點研究中藥治療疾病作用機制的研究學科[9]，代謝組學技術是以代謝物組分析為基礎，借助高通量檢測和多元化數據處理手段，整合多維生物信息系統，闡明中藥復方的藥效物質基礎和作用機制[10]。這兩種研究方法符合中醫藥系統性和整體性的思維模式。張云龍等[11]將網絡藥理學和代謝組學技術相結合應用于解毒化瘀湯改善阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）小鼠認知功能的機制的研究，分析實驗結果得出，解毒化瘀湯通過調控NMDA/ATPase/AMPK 信號通路上調AD 模型小鼠海馬腺苷和腸道Dorea 菌屬水平，顯著改善AD 模型小鼠的學習、記憶障礙，重塑大腦和腸道的溝通。因此，本研究基于系統生物學的整體觀思想，結合網絡藥理學和代謝組學技術，探究苦參烏梅湯抑制HepG 2.2.15 細胞HBVDNA 的作用機制，為探索中藥作用機制提供研究方法和策略。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DIONEX Ultimate 3000 超高效液相色譜儀、Thermo Q Exactive 質譜儀（Themo Fisher 公司）；十萬分之一電子天平（XP-205 型，Mettler Toledo公司）；離心機（Allegra X-30R 型，美國Beckman 公司）；-80℃冰箱（Thermo Fisher 公司）；超純水儀（Milli-Q Advantage A10型，美國Millipore公司）；超聲波清洗器（KQ-250型，昆山市超聲儀器有限公司）；CO2培養箱（Thermo Forma 3111 型，Thermo Fisher公司）。

HepG 2.2.15 細胞株（廣州吉妮歐生物科技有限公司）；DMEM 培養基（HyClone 公司）；精品胎牛血清、G418、胰酶（Solarbio 公司）；苦參飲片（批號：1806011，廠家：河北百草康神藥業有限公司）；烏梅飲片（批號：1806012，廠家：河北百草康神藥業有限公司）；乙腈（LC/MS 級，Merck 公司）、甲醇（色譜級，Merck 公司）；甲酸（色譜級，CNW 公司）；其他試劑均為市售分析純；實驗用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 研究方法

1.2.1 苦參烏梅湯的制備

稱取苦參、烏梅飲片各400 g，加水煎煮兩次，每次30 min，煎液濾過，濾液合并，以離心半徑12 cm、3500 r/min 離心20 min，上清減壓濃縮至0.5 g/ml，再以離心半徑12 cm、20000 r/min 離心30 min，去除殘渣，上清液冷凍干燥，得浸膏粉（每克含生藥5.78 g），置干燥器中備用。

1.2.2 細胞培養及給藥

配制混合高糖培養基（含10%胎牛血清、400 μg/ml G418、1%青霉素、鏈霉素），將HepG 2.2.15 細胞接種其中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。取對數生長期的細胞，按照1×106/ml 接種于96 孔板中，每孔100 μl，培養箱孵育24 h；細胞貼壁后，棄上清液，給藥組分別加入含有不同藥物濃度（156、313、625、1250、2500 μg/ml）的完全培養基，空白組加入等量完全培養基，每組3 個復孔，繼續培養12 h；棄上清液，每孔加入10% CCK-8 完全培養基，繼續培養2 h。每個孔的吸光度值（OD）在450 nm 下測量[12]。計算細胞存活率，以最大無毒劑量應用于后續實驗。HepG 2.2.15 細胞長滿培養瓶后，取出，胰酶消化2 min，棄去消化液，加培養液輕輕吹打。細胞數調整為6×105/ml，接種于6 孔板，每孔2 ml，37℃，5% CO2培養；細胞貼壁后，給藥組加入最大無毒劑量的藥物，空白組加入等量培養基，培養48 h，收集樣品。

1.2.3 樣品收集與處理

細胞培養完成后，收集上清液，采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定HBVDNA 拷貝數。收集細胞，加入500 μl 含0.1%甲酸的甲醇-水（1∶1）反復吹打，超聲破碎細胞，以離心半徑13.5 cm、10 000 r/min 離心10 min 后上清液50 μl 加入450 μl 沉淀劑（甲醇∶乙腈=1∶1）沉淀蛋白，渦旋20 s，4 ℃下靜置10 min，以離心半徑13.5 cm、10 000 r/min 離心10 min 后，取5 μl 進樣，進行UPLC/LTQ-Orbitrap-MS 分析。

1.2.4 代謝組學檢測

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters 公司）；流動相A 為水溶液（含2 mmol/l 甲酸銨和0.1%甲酸），B 為乙腈。梯度洗脫：0～1 min，5% B；1～5 min，5%～60% B；5～8 min，60%～100% B；8～11 min，100% B；11～14 min，100%～60% B；14～15 min，60%～5% B；15～18 min，5%B。流速0.25 ml/min，樣品室溫度保持在4℃，柱溫40℃，進樣量5 μl。

1.2.4.2 質譜條件 離子源為ESI（±）源，負離子檢測模式，噴霧電壓2.80 kV，正離子檢測模式，噴霧電壓3.50 kV，離子傳輸管溫度350℃，S-lens 電壓50%，離子源溫度350℃，鞘氣流速35 arb，輔助氣流速10 arb，吹掃氣流速1 arb。

1.2.5 代謝組學數據處理

利用Trace Finder 軟件自行建立數據庫對UPLC/LTQ-Orbitrap-MS 數據進行預處理，獲得保留時間-質荷比、分子量、觀察量（樣本）和峰強。利用Metabo-Analyst 4.0 軟件將編輯后的數據矩陣進行過濾及歸一化后，進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA），篩選OPLS-DA 分析中VIP 值＞1 的化合物，利用MetaboAnalyst 4.0 軟件和京都基因和基因組數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）網站進行相關的代謝通路分析。

1.2.6 生物靶標的網絡構建

分別以“苦參”“烏梅”為檢索詞，在中醫藥綜合數據庫（traditional Chinese medicine integrated database，TCMID）數據庫檢索各中藥的主要活性成分，篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 的活性候選成分，并獲取其相應的靶點，同時刪除不含有靶點的活性成分。將篩選的化合物導入PubChem 數據庫，轉化為對應的SMILES 文件，并輸入到Swiss Target Prediction 數據庫，篩選其中Probability*＞0.12 的靶標作為中藥活性成分對應的潛在作用靶點。通過GeneCard 數據庫、OMIM 數據庫和DisGeNET 數據庫獲取乙型肝炎相關疾病靶標。使用Cytoscape 3.7.2 軟件繪制苦參烏梅湯治療乙型肝炎的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖[13]。通過DAVID 數據庫將網絡圖中篩選出來的核心靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能和KEGG 通路富集分析，選擇物種“Homo sapiens”，篩選出苦參烏梅湯治療乙型肝炎的潛在信號通路。GO 富集分析包括分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）和細胞組分（cellular components，CC）三個部分。

2 結果

2.1 基于HepG 2.2.15 細胞的苦參烏梅湯抗HBV 研究

不同濃度苦參烏梅湯（156、313、625、1250、2500 μg/ml）作用于HepG 2.2.15 細胞后，細胞存活率分別為（99.2±3.7）%、（89.4±8.4）%、（78.5±5.8）%、（71.2±4.1）%和（63.5±5.0）%。與空白組比較，1250 μg/ml 組和2500 μg/ml 組細胞存活率更低，差異有統計學意義（P ＜0.05），見圖1A。與空白組比較，2500 μg/ml 組HBVDNA 含量更低，差異有統計學意義（P ＜0.05），見圖1B。因此，本研究選擇無毒劑量下具有顯著抗HBV 作用的劑量2500 μg/ml 進行苦參烏梅湯抗HBV 作用的代謝組學研究。

圖1 苦參烏梅湯對HepG 2.2.15 細胞的細胞毒性及HBVDNA 含量的影響

2.2 苦參烏梅湯抗HBV 的代謝組學研究

PCA 分析，空白組與給藥組有效分離，且相同給藥組數據聚集性較好（圖2A）；OPLS-DA 分析（圖2B），基于VIP＞1.0，| P（corr）|≥0.5 且（P ＜0.05，| log2FC |>0）的標準，篩選出組間具有顯著性差異的代謝物40 個，見表1。從KEGG 中得到40 種差異代謝物進行代謝通路分析（圖3），將影響值＞0.10 且-log（P）＞2 的代謝通路作為潛在的靶標代謝通路，發現這些代謝物主要影響苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、鞘脂代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等代謝途徑。

圖2 正、負離子模式下的多元統計分析

圖3 差異代謝物相關代謝通路

表1 潛在生物標志物

2.3 苦參烏梅湯抗HBV 的生物靶標網絡分析

苦參、烏梅中符合條件（OB≥30%，DL≥0.18）的化合物共78 個，潛在靶點416 個。乙型肝炎相關的靶點976 個，兩者取交集，最終獲得苦參烏梅湯候選活性成分的潛在治療乙型肝炎靶點共115 個。苦參烏梅湯治療乙型肝炎的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖見圖4。degree 值排名前3 位的活性成分分別是kusukactone（苦參內脂）、kosamolA（考薩莫A）、kaempferol（山奈酚），可認為是苦參烏梅湯治療乙型肝炎的關鍵成分。苦參烏梅湯治療乙型肝炎的115 個靶點蛋白質-蛋白質相互作用網絡見圖5，degree 值排名前5 位的靶點依次為：蛋白激酶B、人體表皮生長因子受體、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src、腫瘤壞死因子和血管內皮生長因子A，可認為是靶點互作網絡中的關鍵靶點。GO 功能共富集到679 個條目，包括BP 2162個，主要涉及氧化應激反應、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾等方面；CC 56 個，涉及膜筏、膜微區、膜區、轉移酶復合物等；MF 133 個，涉及蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、磷酸酶結合、激素受體結合等。排在前20 位的富集條目進行可視化分析，見圖6。KEGG 通路富集分析中，P 值排名前20 位的通路主要有PI3K-Akt、乙型肝炎、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染等信號通路，見圖7。

圖4 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖

圖5 蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

圖6 基因本體富集分析

圖7 京都基因和基因組數據庫富集分析

3 討論

HBV 感染是病毒與宿主細胞之間進行相互作用的復雜過程，HBV 的復制和表達依賴宿主細胞的能量和代謝過程[14-16]。本研究結果顯示，苦參烏梅湯能夠顯著抑制HepG 2.2.15 細胞分泌HBVDNA，對HepG 2.2.15 細胞代謝物具有顯著的調節作用。因此，推斷中藥干預后影響了宿主細胞的代謝，進而抑制HBV 的表達和復制。

磷脂是組成生物膜的主要成分，參與信號傳導等過程。有研究表明，HBV 感染能引起小鼠肝臟中磷脂酰膽堿的組成發生改變[17]，同時，HBV 感染的HBsAg陽性患者血清中鞘磷脂的含量顯著降低[16]，由此推斷磷脂在HBV 感染和復制及致病的過程中發揮重要作用。本研究代謝組學結果顯示，苦參烏梅湯干預HepG 2.2.15 細胞能夠顯著回調部分差異代謝物鞘磷脂的含量，調節鞘脂代謝通路。

氨基酸是蛋白質的重要組成部分，氨基酸代謝在氨基酸的生物合成和代謝中發揮著重要作用，是細胞增殖、生存和發育的必經途徑[18-19]。苯丙氨酸是人體必需的芳香族氨基酸之一，在正常情況下可以作為氨基酸殘基在人體組織細胞中參與合成各種蛋白質，可在肝臟中產生酪氨酸，而酪氨酸可促進某些酶、激素和神經遞質的分泌[20]，苯丙氨酸代謝的穩定狀態有助于人體正常生長發育和生理機能的維持[21]。本研究顯示，苦參烏梅湯干預HepG 2.2.15 細胞后，L-苯丙氨酸水平顯著降低，提示其可通過作用于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成及苯丙氨酸代謝通路發揮抗HBV 的作用。

此外，本研究采用網絡藥理學方法構建“中藥-成分-靶點-疾病”相互作用網絡，該網絡的關鍵作用靶點有蛋白激酶B、人體表皮生長因子受體、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src、腫瘤壞死因子和血管內皮生長因子A 等，所富集的關鍵相關通路為PI3K/Akt，是調節細胞增殖、凋亡、分化和葡萄糖轉運等功能的重要通路[22-24]，代謝組學篩選出組間具有顯著性差異的代謝物40 個，其中包括葡萄糖含量顯著改變，與網絡藥理學結果相吻合。研究表明，HBV 感染患者隨著病情的不斷發展，其肝臟損傷會不斷加重，進而影響其機體葡萄糖代謝，容易出現血糖升高，誘發糖尿病[25-26]。因此，網絡藥理學與代謝組學的聯用，對中藥干預的機體代謝組群進行整合分析，更有益于揭示中藥治療疾病機制[27-29]。

綜上所述，本研究采用代謝組學和網絡藥理學相結合的策略，更加全面地解釋了苦參烏梅湯在抗HBV 方面的可能機制。該方法為進一步研究中藥抗HBV 潛在的治療靶點提供線索，為藥物作用機制研究與闡釋提供了新思路。