1,25(OH)2D3通過調節氧化還原狀態影響豬前體脂肪細胞分化

田程程，張 晶，符 璐，蔣蘇蘇,2，武殿虎，盧建雄，張國華*

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅農業職業技術學院，甘肅 蘭州 730020）

脂肪形成是前體脂肪細胞增殖及分化為成熟脂肪細胞的復雜過程。在經歷了形態學和生物化學變化后前體脂肪細胞分化脂肪細胞，參與脂肪合成、脂肪酸跨膜轉運及胰島素信號應答等多種生物學過程。脂肪細胞數量的增加和體積的增大是動物體脂沉積的生物學基礎，其調控機制備受關注。遺傳因子、營養、氧化還原狀態等多種內、外環境因素都會影響脂肪細胞分化。維生素D不僅作為營養物質可以調節鈣磷代謝，也具有調節免疫功能、抑制腫瘤生長和調控細胞分化發揮激素類物質的作用。它是一組具有生物活性的脂溶性類固醇衍生物[1]，在肝臟經25-羥化酶CYP2R1和CYP27A1作用轉變成25(OH)D3，然后在腎臟由1α羥化酶CYP27B1催化為1,25(OH)2D3。24-羥化酶CYP24A1可將1,25(OH)2D3分解為水溶性代謝產物d3-23羧酸（calcitroic acid）排出體外。25(OH)D3和1,25(OH)2D3是維生素D主要的生物活性形式，也是維生素D受體（Vitamin Dreceptor）的天然配體[2]。當1,25(OH)2D3與其受體結合后，可誘導多種細胞增殖、分化及凋亡相關基因表達[3]。1,25(OH)2D3以劑量依賴方式下調3T3-L1前體脂肪細胞轉錄因子增強子結合蛋白α（C/EBPα）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）及其下游脂代謝相關基因LPL和aP2等的表達，抑制成脂分化[4]。用25(OH)D3或1,25(OH)2D3處理可抑制乳腺前體脂肪細胞分化過程的啟動[5]。脂肪組織是維生素D主要的貯存場所之一，日糧多不飽和脂肪酸通過調控維生素代謝酶的表達影響豬脂肪組織維生素D代謝，從而調節脂肪合成[6]。研究發現，低濃度的1,25(OH)2D3通過降低PPARγ的表達，可減弱豬前體脂肪細胞分化，但高濃度的1,25(OH)2D3通過提高PPARγ的表達，可增強分化[7]，但其作用機制尚不清楚。

硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）氧化還原系統是機體重要的抗氧化系統，參與細胞氧化還原狀態的調節[8]，對機體健康和代謝起著重要作用。硫氧還蛋白互作蛋白（Txnip）是一種維生素D3上調蛋白1（Vitamin D3up-regulated protein 1,VDUP1），可通過抑制硫氧還蛋白的還原活性調節細胞氧化還原狀態[9]，調控脂肪細胞分化[10]。因此，維生素D可能通過調控細胞氧化還原影響脂肪細胞分化。本試驗通過分離培養豬前體脂肪細胞，分析不同濃度1,25(OH)2D3對細胞分化及氧化還原平衡狀態的影響，探討維生素D調控豬脂肪細胞分化的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

牛血清白蛋白（Gibco，美國）；地塞米松（DEX）、1,25(OH)2D3、胰島素（Sigma公司）；DMEM/F12 培養基、胎牛血清（HyClone，美國）；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、油紅O、臺盼藍和DMSO（Solarbio公司，北京）；RNA提取、反轉錄及PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）；PCR引物由上海生工生物工程公司合成；3日齡仔豬（Sus scrofa）購自蘭州瑞源農業科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 皮下前體脂肪細胞培養及誘導分化 3日齡仔豬體表清洗、消毒后乙醚麻醉處死，按本實驗室已建立的脂肪細胞分離、培養方法[11]，無菌條件解剖分離皮下脂肪組織，PBS漂洗，剪成組織小塊，用濃度1%的Ⅰ型膠原酶在37 ℃水浴中消化60 min左右后，等體積完全培養液終止消化，100目篩網過濾。收集濾液，1 000 r/min離心10 min，沉淀用培養液漂洗后，用10%血清培養液重懸細胞，然后以6×104/cm2密度接種于24孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。隔天換液。細胞生長至約80%匯合后，用成脂分化培養液培養48 h，然后換用1,25(OH)2D3終濃度為0 nmol/L（對照）、0.1 nmol/L和100 nmol/L的維持培養液培養，隔日換液，于成脂誘導后2 d、4 d、6 d、8 d和10 d檢測細胞分化及提取總RNA。

1.2.2 油紅O染色提取法檢測細胞分化 分別在誘導成脂分化的2 d、4 d和6 d，按于淇等[10]報道的油紅O染色提取法，測定為510 nm的吸光度值。

1.2.3 細胞氧化還原指標檢測 誘導分化后第6 d，在每孔細胞中加入1 ml胰酶消化，收集細胞，用冰冷的PBS洗滌3次后，反復凍融裂解細胞，4 ℃、1 000 r/min離心10 min，收集上清液，用豬活性氧（ROS）、還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）酶聯免疫吸附測定試劑盒（上海江萊生物科技有限公司），按照使用說明書測定ROS、GSH和GSSG。

1.2.4 基因mRNA表達檢測 誘導分化6 d的細胞棄培養液后，用試劑盒提取總RNA，反轉錄合成cDNA。按生產商使用說明書，制備實時熒光PCR反應混合液（20 μl），包括上、下游引物（10 μmol/L）各1 μl、cDNA 2 μl。引物信息見表1，反應程序見文獻[11]。用2-ΔΔCt法計算基因相對表達水平，β-actin作為內參。

表1 引物序列

1.2.5 統計分析 用SPSS 20.0統計軟件對試驗數據進行單因素方差分析，Duncan's法進行多重比較，試驗結果用平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 1,25(OH)2D3對豬前體脂肪細胞分化的影響

豬前體脂肪細胞成脂誘導后，分別以0.1 nmol/L和100 nmol/L 1,25(OH)2D3處理。成脂誘導6 d后脂肪細胞油紅O染色結果見圖1。在成脂誘導2 d、4 d和6 d后，0.1 nmol/L 1,25(OH)2D3處理組細胞的分化水平顯著低于對照組（P＜0.05），而100 nmol/L 1,25(OH)2D3處理組細胞的分化水平顯著高于對照組（P＜0.05）（圖2）。可見，低濃度1,25(OH)2D3抑制豬前體脂肪細胞分化，高濃度1,25(OH)2D3促進分化。

圖1 成脂誘導6 d后豬脂肪細胞油紅O染色結果

圖2 1,25(OH)2D3對豬脂肪細胞分化的影響

2.2 1,25(OH)2D3對細胞氧化還原狀態的影響

1,25(OH)2D3處理的豬前體脂肪細胞在成脂誘導6 d后，檢測細胞ROS、GSH和GSSG水平，結果如表2所示。與對照組相比，0.1 nmol/L濃度1,25(OH)2D3處理極顯著提高細胞ROS和GSSG水平（P＜0.01），極顯著降低GSH水平及GSH/GSSG比值（P＜0.01），而100 nmol/L濃度1,25(OH)2D3處理極顯著降低細胞ROS和GSSG水平（P＜0.01），極顯著提高GSH水平及GSH/GSSG比值（P＜0.01）。

表2 1,25(OH)2D3對豬前體脂肪細胞氧化還原狀態的影響

2.3 1,25(OH)2D3對細胞氧化還原相關基因表達的影響

采用實時熒光PCR檢測誘導分化后6 d脂肪細胞Trx、SOD2和Prx3mRNA表達，結果如圖3所示。與對照組相比，0.1 nmol/L濃度1,25(OH)2D3處理和100 nmol/L濃度1,25(OH)2D3處理均極顯著降低Trx mRNA表達（P＜0.01）；100 nmol/L 1,25(OH)2D3處理顯著上調SOD2和Prx3mRNA表達，但0.1 nmol/L 1,25(OH)2D3對其表達影響不顯著。

圖3 1,25(OH)2D3對豬脂肪細胞氧化還原相關基因表達的影響

3 討論

脂肪組織是動物體內維生素D貯存的主要組織之一，其活性形式1,25(OH)2D3也以自分泌和旁分泌方式影響脂肪形成[12]。對嚙齒動物來源的前體脂肪細胞3T3-L1和PA6等的研究表明，1,25(OH)2D3抑制其成脂分化及脂滴聚集[4]。Ji等[13]發現10～100 nmol/L濃度1,25(OH)2D3通過降低成脂關鍵因子PPARγ及其下游脂代謝相關基因表達，抑制3T3-L1前體脂肪細胞分化。盡管1,25(OH)2D3以劑量依賴方式降低PPARγ和C/EBPα表達，抑制3T3-L1細胞分化，但這種作用只發生在成脂分化起始階段[4]。100 nmol/L 1,25(OH)2D3抑制3T3-L1細胞分化，但促進小鼠和人類原代培養前體脂肪細胞分化及PPARγ表達[14]。不同濃度1,25(OH)2D3對Ob17細胞成脂分化有不同的影響，低濃度時促進分化，高濃度時抑制分化[15]。但Lenoir等[16]得到相反結果，即維生素D濃度大于0.25 nmol/L時促進Ob17細胞分化，小于0.25 nmol/L時抑制分化。此外，1,25(OH)2D3以劑量依賴方式抑制豬皮下前體脂肪細胞分化[17]，但促進豬骨髓間充質干細胞成脂分化[18]。這些研究結果的分歧可能與細胞來源及1,25(OH)2D3的濃度有關。本試驗結果表明，低濃度（0.1 nmol/L）1,25(OH)2D3抑制豬皮下前體脂肪細胞分化，而高濃度（100 nmol/L）促進分化。與此一致，岳小婧等[7]報道0.1～1 nmol/L 1,25(OH)2D3抑制豬前體脂肪細胞分化，而濃度為10～100 nmol/L時促進分化。

氧化還原系統是生物體內的一種重要調節機制，在細胞增殖、分化和凋亡過程中發揮著重要作用。氧化還原狀態是超氧陰離子（O2?）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（OH）等活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）、二氧化氮（NO2）等活性氮（RNS），與酶系統和非酶系統組成的抗氧化防御系統之間相互作用的結果[19-20]。低濃度ROS和RNS是氧化還原信號的效應器，但積累過多以及抗氧化防御受損時，就會發生氧化應激，導致細胞功能及代謝改變[21]。谷胱甘肽（glutathione,GSH）是重要的親水性抗氧化劑，可以通過非酶反應清除氧自由基，但GSH介導的過氧化氫還原需要谷胱甘肽過氧化物酶的催化[22]。GSH與氧化劑作用后形成的氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,GSSG），在依賴NADPH的GSH還原酶和硫氧還蛋白氧化還原系統的作用下還原為GSH。GSH/GSSG是動物體主要的氧化-還原對之一，其比值可反映出細胞氧化還原狀態的動態變化。豬前體脂肪細胞用低濃度1,25(OH)2D3處理時，細胞ROS和GSSG水平提高，GSH水平降低，導致GSH/GSSG比值顯著降低，反映了低濃度1,25(OH)2D3導致細胞氧化還原狀態向氧化態轉變；相反，高濃度1,25(OH)2D3處理，豬前體脂肪細胞ROS和GSSG水平降低，而GSH水平及GSH/GSSG比值提高，表明細胞向還原態轉變。研究表明，氧化應激通過降低C/EBP DNA結合活性抑制3T3-L1前體脂肪細胞分化[23]，H2O2處理可下調PPARγ表達，降低C/EBP DNA結合活性，抑制3T3-L1細胞分化[24]。由此可見，1,25(OH)2D3可通過影響細胞氧化還原狀態調節豬前體脂肪細胞分化。

超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase，SOD2）是細胞內線粒體抵御ROS氧化損傷的重要抗氧化金屬酶，催化超氧陰離子歧化生成過氧化氫和氧，發揮抗氧化作用。過氧化物氧化還原酶（peroxredoxins，Prxs）作為線粒體抗氧化酶，在3T3-L1成熟脂肪細胞活性較高，但在肥胖小鼠和人類肥胖者的脂肪組織中活性降低[25]。Prx3是調節脂肪細胞氧化應激和脂肪因子表達的關鍵分子，Prx3基因敲除后，3T3-L1細胞超氧化物水平升高，氧化應激調節異常[26]。提高SOD2和Prx3表達可清除過量產生的ROS[27-28]。在高濃度1,25(OH)2D3處理的豬脂肪細胞，SOD2和Prx3基因表達顯著提高，可能意味著細胞代謝生成的過量ROS被清除，GSH/GSSG比值提高。相比之下，低濃度1,25(OH)2D3處理對Prx3和SOD2表達均無顯著影響，細胞積累更多的ROS，GSH/GSSG降低。此外，Trx是硫氧還蛋白氧化還原系統的主要組成成分，Txnip通過抑制Trx的還原活性調節細胞氧化還原狀態。1,25(OH)2D3顯著提高豬脂肪細胞Txnip基因表達[29]。本研究中，1,25(OH)2D3顯著降低豬脂肪細胞Trx mRNA表達，且高濃度1,25(OH)2D3比低濃度有更大幅度的下調，提示1,25(OH)2D3也可能通過改變Trx表達水平調節細胞氧化還原穩態，對豬前體脂肪細胞分化產生影響。

4 結論

1,25(OH)2D3可通過改變細胞氧化還原狀態，影響豬前體脂肪細胞分化。高濃度1,25(OH)2D3上調SOD2和Prx3表達、減少細胞ROS積累，氧化還原狀態向還原態偏移，促進豬前體脂肪細胞分化；相反，低濃度1,25(OH)2D3處理可使細胞ROS積累增加，氧化還原狀態偏向氧化態，抑制豬前體脂肪細胞分化。