HA基因真核表達載體構建及在293T細胞中的表達

李方琳，王慧慧，粟雨芯，馬忠仁*

（1.西北民族大學 生物醫學研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

人流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染性疾病。據世界衛生組織估計，流感病毒每年感染率高達5%～10%，老年人是高危人群[1-2]。因此，流感在威脅公共健康的同時，也增加了國家和社會的經濟負擔[3]。血凝素（Hemagglutinin,HA）和神經氨酸酶（Neuraminidase,NA）是流感病毒2種表面抗原，其抗原性強，容易變異，致使人群對新毒株的免疫力下降，給疫苗研制與生產帶來了挑戰[4]。目前，接種流感疫苗是預防和控制流感最為有效的措施，及時接種流感疫苗，既能減少流感病毒感染，又能減輕流感癥狀[5]。DNA疫苗因其免疫效果好、危險性低、價格低廉、易于貯藏和運輸等優點受到廣泛關注[6-9]。近年來，流感病毒的DNA疫苗研究取得了較大進展。針對人流感分離株H5N1的DNA疫苗研究結果表明，該研究中所構建的H5N1的DNA疫苗能夠誘導小鼠產生免疫反應[10]。此外，有學者已經成功構建出2013年暴發的禽流感的病原體H7N9的DNA疫苗[11]。本試驗旨在構建甲型流感病毒（H1N1）血凝素（HA）的pcDNA3.1(+)真核表達質粒（pcDNA3.1(+)-HA），為后續其作為DNA疫苗免疫實驗動物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎上皮細胞系（293T）由西北民族大學生物醫學研究中心凍存傳代；E.coli BL21感受態細胞由西北民族大學生物工程與技術實驗室制備；引物由楊凌天潤奧科生物科技有限公司合成，熒光定量內參為GAPDH。

1.2 主要試劑

DL10000 Marker、DL2000 Marker、限制性內切酶BamH I和Xho I均購于TAKARA生物技術有限公司；聚合酶鏈式反應（PCR）試劑（北京博奧龍免疫技術有限公司），TreliefTM SoSoo Cloning Kit（北京擎科生物技術有限公司），胎牛血清（蘭州民海生物工程有限公司），DMEM高糖培養基（蘭州百靈生物技術有限公司），轉染試劑（Invigentech公司）；總RNA提取試劑（上海雅酶生物醫藥科技有限公司），反轉錄及熒光定量試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；β-Actin、抗甲型流感H1N1 HA抗體（兔源，Abcam)；山羊抗兔IgG抗體（HRP標記，Abcam）。

1.3 方法

1.3.1 目的基因的擴增與連接 采用PCR技術，以H1N1流感病毒cDNA為模版，上游引物為5’-TGGAAATGGCTGCTTCGAGT-3’、下游引物為5’-TTGCCTCCTCGCTGTACTTG-3’，擴增目的基因大小為1 700 bp左右。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，進行回收與純化。

用限制性內切酶BamH I和Xho I按表1反應體系酶切pcDNA3.1(+)質粒和目的基因，經瓊脂糖凝膠電泳、純化、回收線性載體和目的基因后，用TreliefTM SoSoo Cloning Kit進行連接。連接產物即重組質粒命名為pcDNA3.1(+)-HA。將連接產物轉化至BL21感受態，37 ℃、200～220 rpm放大培養，抽提質粒后進行雙酶切驗證。

表1 雙酶切反應體系（20 μl）

1.3.2 質粒轉染及熒光定量 293T細胞由含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養基，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養。轉染前培養于6孔板中，當細胞密度達60%左右時，使用Invigentech公司轉染試劑按照操作說明書將pcDNA3.1 (+)與成功構建的pcDNA3.1 (+)-HA重組質粒分別與轉染試劑按照1∶1混勻，混合液于室溫孵育10～15 min后，加入含有完全培養基的293T細胞中培養24 h后，換液培養至48 h，其中以不轉染細胞作為空白對照組，pcDNA3.1 (+)轉染為陰性對照組。隨后提取細胞RNA并反轉錄，通過熒光定量觀察HA基因在293T細胞中的mRNA相對表達情況。

1.3.3 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測HA的表達 各組質粒轉染48 h后，經PBS清洗數次，收集細胞并加入RIPA裂解液500 μl（含有1%的PMSF），抽提蛋白。用BCA法定量，經SDSPAGE凝膠電泳后用濕轉的方法轉移到PVDF膜上，封閉后，孵育一抗，二抗4 ℃過夜孵育后，顯影拍照并保存。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增與重組質粒鑒定

設計引物進行PCR擴增，擴增片段大小為1 700 bp左右，與預期大小相符（圖1A）。重組質粒經BamH I和Xho I酶切后，電泳結果出現1 700 bp的目的條帶（圖1B）。結果表明pcDNA3.1 (+)-HA重組質粒構建成功。

圖1 HA PCR產物電泳及pcDNA3.1 (+)-HA雙酶切

2.2 HA基因mRNA表達水平

將質粒轉染293T細胞48 h后的熒光定量結果顯示，與對照組相比，轉染后293T細胞內HA的mRNA表達顯著上升（P＜0.000 1，圖2），這一結果也進一步表明pcDNA3.1 (+)-HA重組質粒構建成功并且能在293T細胞中表達。pcDNA3.1 (+)-HA轉染組HA的mRNA表達水平顯著高于空白對照及空載轉染組（P＜0.000 1，圖2）。

圖2 pcDNA3.1 (+)-HA轉染293T細胞后HA mRNA表達

2.3 Western blot驗證pcDNA3.1 (+)-HA在293T細胞中的蛋白表達

轉染293T細胞48 h提取蛋白，經Western Blot檢測HA蛋白的表達。圖3表明，轉染pcDNA3.1 (+)-HA重組質粒組，出現特異性條帶，即HA蛋白，而未轉染及空載組無條帶，與mRNA水平一致（圖2），說明真核表達載體pcDNA3.1 (+)-HA轉染293T細胞后，細胞內HA蛋白的表達明顯增加。

圖3 Western Blot檢測pcDNA3.1 (+)-HA轉染293T細胞后HA的蛋白表達

3 討論與結論

甲型流感病毒傳染性較強，容易形成大流行。HA是流感病毒表面主要的結構蛋白之一，也是甲型流感病毒主要的表面抗原，它能產生保護人類的中和抗體[12]，因此是疫苗開發的靶點[13]，也是DNA疫苗的聚焦點。重組質粒是研究基因功能的常用手段之一，也是DNA疫苗的主要技術。DNA疫苗作為新興的生物技術產品已被充分肯定，應用前景較好。

為了進一步研究DNA疫苗的免疫效果，本研究通過P C R 等技術成功構建重組質粒pcDNA3.1 (+)-HA，驗證后將其轉染293T細胞，48 h后對細胞內HA進行mRNA及蛋白水平檢測。結果表明，轉染后細胞內無論是mRNA水平，還是蛋白表達水平都顯著增加，證明成功構建真核表達載體pcDNA3.1 (+)-HA，可為后續DNA的研究提供材料。