不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑對(duì)膜性腎病大鼠腎功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

李 晶，王一強(qiáng)，張玉香，史曉偉，姜 蕾，姜德民*

（1.甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730207；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

膜性腎?。∕embranous Nephropathy，MN）是成人腎病綜合征的主要原因，本病起病隱匿，早期癥狀不明顯，隨病程發(fā)展，可出現(xiàn)大量蛋白尿、高度水腫、低蛋白血癥、高血壓、高脂血癥、腎功能損傷等臨床表現(xiàn)[1]。該病發(fā)病率逐年遞增，嚴(yán)重影響患者的工作和生活質(zhì)量，還有向終末期腎功能衰竭和尿毒癥轉(zhuǎn)歸的危險(xiǎn)，給患者帶來巨大的壓力[2-3]。近年來，中醫(yī)藥治療MN的研究取得了令人矚目的進(jìn)展，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，MN屬本虛標(biāo)實(shí)證，以脾腎氣虛為本，水濕、濕熱、瘀血為標(biāo)，治當(dāng)益腎健脾培其本，并輔活血利水、清利濕熱、攝精固澀、祛風(fēng)通絡(luò)、搜風(fēng)剔絡(luò)等法以治其標(biāo)[4-6]。有研究表明，黃芪當(dāng)歸合劑能促進(jìn)肝臟蛋白質(zhì)合成，提高血漿蛋白水平，改善蛋白質(zhì)代謝紊亂[7]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯取于李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》，其中介紹黃芪，味甘，性微溫，歸脾肺經(jīng)，可補(bǔ)氣健脾，益衛(wèi)固表，利尿消腫；當(dāng)歸，味甘辛，性溫，歸肝、心、脾經(jīng)，可補(bǔ)血調(diào)經(jīng)，活血止痛，兩藥合用有氣血雙補(bǔ)之效，可用于MN中腎氣虧虛兼氣血（陰）虛者[8]。本實(shí)驗(yàn)研究通過不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑干預(yù)MN大鼠，進(jìn)一步說明不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑對(duì)MN大鼠治療效果的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

選取SPF級(jí)別，同批雄性SD大鼠150只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（150±20）g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK（甘）2011-0001。其中，140只大鼠為實(shí)驗(yàn)用大鼠，10只大鼠為備用大鼠。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物置于室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1周，室溫18℃～20℃，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，飲用自來水。

1.2 藥物

本研究使用藥物包括當(dāng)歸補(bǔ)血湯中藥煎劑（黃芪30 g、當(dāng)歸6 g），由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備；當(dāng)歸補(bǔ)血口服液（鄭州市協(xié)和制藥廠，批號(hào):012003041）；當(dāng)歸補(bǔ)血丸（商丘市金馬藥業(yè)有限公司，批號(hào):20062012）；當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒配方（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院購(gòu)買）。

1.3 試劑

血清總膽固醇（TC）試劑盒、甘油三酯（TG）試劑盒（上海朝瑞生物科技有限公司）、血清總蛋白（TP）試劑盒（保定長(zhǎng)城臨床試劑有限公司）；牛血清白蛋白（C-BSA）、弗氏不完全佐劑（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）、血肌酐（CRE）測(cè)定試劑盒、血尿素氮（BUN）測(cè)試盒（上?？迫A生物工程股份有限公司）等。

1.4 儀器

HH-S型數(shù)顯恒溫水浴箱（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；5417R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)EPPENDORF公司）；ZY KHB-1280型全自動(dòng)生化分析儀（上?？迫A生物工程股份有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組與造模

將140只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為14組，每組10只:空白組，模型組，當(dāng)歸補(bǔ)血湯煎劑低、中、高劑量組（以下分別簡(jiǎn)稱:煎劑低劑量組、煎劑中劑量組、煎劑高劑量組），當(dāng)歸補(bǔ)血口服液低、中、高劑量組（以下分別簡(jiǎn)稱:口服液低劑量組、口服液中劑量組、口服液高劑量組），當(dāng)歸補(bǔ)血丸低、中、高劑量組（以下分別簡(jiǎn)稱:丸劑低劑量組、丸劑中劑量組、丸劑高劑量組），當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒配方低、中、高劑量組（以下分別簡(jiǎn)稱:顆粒低劑量組、顆粒中劑量組、顆粒高劑量組）。常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，測(cè)其24 h UTP均在正常范圍。將1 mg C-BSA加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液PBS（pH為7.4）中配制成溶液，然后與同等量的弗氏不完全佐劑混勻，使其充分乳化。除空白組外，模型組和給藥組大鼠的背部、雙側(cè)腹股溝及腋下做多點(diǎn)皮下注射進(jìn)行預(yù)免疫（隔日一次），一周3次。預(yù)免疫1周后，開始正式免疫，即模型組和給藥組每只大鼠隔日一次尾靜脈注射C-BSA 16 mg/kg（注射前用1 mL PBS配成溶液），每周注射3次，連續(xù)注射4周[2，9]?？瞻捉M及模型組給予生理鹽水，每日灌胃一次，連續(xù)4周，于實(shí)驗(yàn)前（0 d）和制模后 6、12、18、24、30 d 測(cè)量體重，并根據(jù)體重調(diào)整給藥量。

2.2 給藥方法

造模結(jié)束后，各組進(jìn)行灌胃治療。參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[2]，大鼠的給藥量為黃芪2.5 g/kg、當(dāng)歸0.5 g/kg。藥物組低劑量組給予黃芪1.25 g/kg、當(dāng)歸0.25 g/kg，中劑量組給予黃芪2.5 g/kg、當(dāng)歸0.5 g/kg，高劑量組給予黃芪5 g/kg、當(dāng)歸1 g/kg。使用時(shí)，用蒸餾水將不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑配成小劑量組黃芪0.062 5 g/mL、當(dāng)歸0.012 5 g/mL，中劑量組黃芪0.125 g/mL、當(dāng)歸0.025 g/mL，大劑量組黃芪0.250 g/mL、當(dāng)歸0.05 g/mL的溶液。空白組與模型組分別給予生理鹽水，給藥組分別給予不同濃度的不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑溶液，灌胃量為4 mL/d，1次/d，各組連續(xù)給藥4周。

2.3 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

本研究通過觀察不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑對(duì)MN大鼠24 h尿蛋白定量（UTP）、血清總蛋白（TP）、血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血肌酐（CRE）和血尿素氮（BUN）水平，闡述不同劑型對(duì)MN大鼠的治療作用。

2.3.1 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)各組大鼠分別于造模前、造模后0周、給藥2周后、給藥4周后放入代謝籠中，收集24 h尿液。給藥4周后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，暴露腹腔，腹主動(dòng)脈取血，離心10 min后分出血清，檢測(cè)生化指標(biāo)。

2.3.2 指標(biāo)檢測(cè) 采用雙縮脲法測(cè)定大鼠24 h UTP，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清UTP、TC、TG、TP、CRE和BUN水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)MN大鼠一般狀況的影響

空白組大鼠精神狀態(tài)佳，反應(yīng)靈敏，進(jìn)食及飲水量正常，毛發(fā)有光澤。造模后，與空白組比較，模型組大鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)及進(jìn)食、飲水減少，毛發(fā)光澤減弱甚至脫落，尿量增多，大便稀溏，部分大鼠出現(xiàn)腹部皮下水腫。灌胃治療后，與模型組相比，不同劑型當(dāng)歸補(bǔ)血制劑組大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)、飲食、飲水、毛發(fā)脫落、大便等情況均有好轉(zhuǎn)。

3.2 對(duì)MN大鼠24 h尿蛋白定量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白組、模型組和各給藥組造模前的 24 h UTP值之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。造模后，模型組和各給藥組與空白組比較，24 h UTP明顯增加（P＜0.05）。給藥后各給藥組與模型組比較，24 h UTP明顯下降（P＜0.05），但仍高于空白組（P＜0.05）。給藥治療2周后，顆粒中、低劑量組，口服液中、低劑量組的24 h UTP高于煎劑高劑量組（P＜0.05）。給藥治療4周后，顆粒低劑量組，口服液中、低劑量組的24 h UTP仍高于煎劑高劑量組（P＜0.05）。見表1。

表1 不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑對(duì)MN大鼠24 h UTP的影響（±s，mg/24 h）

表1 不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑對(duì)MN大鼠24 h UTP的影響（±s，mg/24 h）

注:與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與煎劑高劑量組比較，ΔP＜0.05

組別n 造模前 造模后0周 給藥后2周 給藥后4周空白組模型組煎劑高劑量組煎劑中劑量組煎劑低劑量組口服液高劑量組口服液中劑量組口服液低劑量組丸劑高劑量組丸劑中劑量組丸劑低劑量組顆粒高劑量組顆粒中劑量組顆粒低劑量組10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 6.50±0.83 6.60±0.91 6.60±0.79 6.60±0.65 6.50±0.89 6.70±0.31 6.60±0.87 6.60±0.77 6.50±0.98 6.70±0.41 6.70±0.28 6.60±0.67 6.60±0.59 6.50±0.94 76.50±0.51 42.30±0.78*48.80±0.97*39.60±0.88*39.90±0.79*41.10±0.12*41.60±0.31*42.10±0.89*40.60±0.87*40.90±0.66*41.10±0.91*40.80±0.79*41.20±0.71*41.80±0.43*77.60±1.65 59.20±20.89*26.90±10.77*#28.10±10.91*#30.30±11.56*#31.40±0.15*#35.30±11.10*#Δ 36.10±10.89*#Δ 27.70±10.65*#28.10±10.81*#30.50±12.13*#29.20±10.10*#33.80±11.99*#Δ 34.20±12.34*#Δ 77.20±1.78 64.60±23.05*20.70±7.11*#22.20±6.43*#25.10±4.64*#24.40±8.17*#25.80±8.31*#Δ 26.30±7.78*#Δ 20.90±6.70*#21.40±6.33*#25.20±5.67*#22.50±6.81*#23.70±6.75*#25.70±7.66*#Δ

3.3 對(duì)MN大鼠血清TP、TC及TG水平的影響

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過4周的治療后，與空白組比較，模型組，顆粒低劑量組和口服液中、低劑量組大鼠的TP水平顯著降低（P＜0.05），TC和TG 水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，不同劑型當(dāng)歸補(bǔ)血制劑組大鼠血清TP水平均有不同程度的升高，TC和TG水平均有不同程度的降低。其中，煎劑高、中、低劑量組，丸劑高、中、低劑量組，顆粒高劑量組和口服液高劑量組的血清TP水平顯著升高（P＜0.05），TC和TG水平顯著降低（P＜0.05）。與煎劑高劑量組比較，顆粒低劑量組和口服液中、低劑量組的TP水平顯著降低（P＜0.05），TC和TG水平顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑對(duì)MN大鼠血清TP、TC和TG的影響（±s）

表2 不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑對(duì)MN大鼠血清TP、TC和TG的影響（±s）

注:與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與煎劑高劑量組比較，ΔP＜0.05

組別n TP（g/dL）TC（mmol/L）TG（mmol/L）空白組模型組煎劑高劑量組煎劑中劑量組煎劑低劑量組口服液高劑量組口服液中劑量組口服液低劑量組丸劑高劑量組丸劑中劑量組丸劑低劑量組顆粒高劑量組顆粒中劑量組顆粒低劑量組10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 41.57±2.83#32.75±1.40*39.89±2.49#38.71±1.83#37.56±1.54#37.86±1.45#35.41±1.02*Δ 34.69±0.86*Δ 39.24±1.22#38.01±0.78#36.94±1.07#38.11±1.15#36.53±0.64 35.22±0.73*Δ 1.43±0.34#1.84±0.38*1.59±0.41#1.61±0.21#1.68±0.33#1.70±0.22#1.72±0.18*Δ 1.75±0.41*Δ 1.63±0.35#1.69±0.15#1.70±0.28#1.67±0.14#1.70±0.21 1.74±0.35*Δ 0.86±0.13#1.49±0.53*0.94±0.27#1.06±0.43#1.14±0.37#1.17±0.36#1.22±0.57*Δ 1.25±0.49*Δ 0.98±0.25#1.10±0.41#1.16±0.45#1.11±0.33#1.19±0.51 1.23±0.47*Δ

綜上所述，在不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑中，煎劑高、中、低劑量組，丸劑高、中、低劑量組，顆粒高劑量組和口服液高劑量組對(duì)改善MN大鼠血清TP、TC和TG水平具有一定療效。

3.4 對(duì)MN大鼠血清BUN和CRE水平的影響

結(jié)果顯示，各組間BUN水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。CRE水平:與空白組比較，模型組，顆粒低劑量組和口服液中、低劑量組更低（P＜0.05）；與模型組比較，煎劑中、高劑量組，丸劑中、高劑量組，顆粒高劑量組和口服液高劑量組的CRE水平更高（P＜0.05）；與煎劑高劑量組比較，顆粒低劑量組和口服液中、低劑量組CRE水平更低（P＜0.05），但各組水平均在正常值范圍。見表3。

表3 不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑對(duì)MN大鼠血清BUN和CRE的影響（±s）

表3 不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑對(duì)MN大鼠血清BUN和CRE的影響（±s）

注:與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與煎劑高劑量組比較，ΔP＜0.05

組別n BUN（mmol/L）CRE（μmol/L）空白組模型組煎劑高劑量組煎劑中劑量組煎劑低劑量組口服液高劑量組口服液中劑量組口服液低劑量組丸劑高劑量組丸劑中劑量組丸劑低劑量組顆粒高劑量組顆粒中劑量組顆粒低劑量組10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 7.86±0.63 7.04±0.51 7.69±1.29 7.60±0.45 7.58±0.54 7.56±0.37 7.50±0.44 7.48±0.51 7.63±0.72 7.58±0.27 7.53±0.33 7.60±0.84 7.57±0.81 7.50±0.55 50.08±3.79 40.10±4.85*47.71±4.81#46.74±4.53#44.43±3.88 46.12±3.94#43.82±4.33*Δ 42.15±4.67*Δ 47.11±3.94#46.23±3.71#44.00±4.13 46.46±4.62#44.87±4.55 43.39±3.78*Δ

4 討論

4.1 對(duì)MN大鼠24 h尿蛋白定量的影響

蛋白尿是MN大鼠的主要臨床表現(xiàn)，是影響本病治療的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑干預(yù)治療后的MN大鼠的24 h UTP有不同程度的下降，說明不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑可降低MN大鼠的尿蛋白，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用當(dāng)歸補(bǔ)血煎劑與丸劑比較，MN大鼠24 h尿蛋白量下降差異不明顯，但使用這兩者均明顯低于使用顆粒劑和口服液的24 h尿蛋白量。

4.2 對(duì)MN大鼠血清TP、TC及TG水平的影響

大量的蛋白隨尿液排出，導(dǎo)致血漿中蛋白減少，血漿膠體滲透壓降低，出現(xiàn)水腫現(xiàn)象。而血漿中蛋白降低，出現(xiàn)低蛋白血癥時(shí)可誘發(fā)肝臟合成膽固醇、甘油三酯增多，導(dǎo)致血脂升高。該實(shí)驗(yàn)研究中，經(jīng)不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑干預(yù)治療后的MN大鼠的TP水平有不同程度的升高，TC和TG水平均有不同程度的降低，說明不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑可以提高血清總蛋白，調(diào)節(jié)血脂，減少M(fèi)N并發(fā)癥的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)也顯示，使用當(dāng)歸補(bǔ)血煎劑與丸劑比較，MN大鼠的TP水平、TC和TG水平差異不明顯，但使用這兩者的TP水平均明顯高于使用顆粒劑和口服液，TC和TG水平均明顯低于使用顆粒劑和口服液。

4.3 對(duì)MN大鼠血清BUN和CRE水平的影響

當(dāng)腎臟受損時(shí)，腎小球?yàn)V過膜結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，進(jìn)而影響腎小球的濾過功能。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，經(jīng)不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑干預(yù)治療后，MN大鼠的血清CRE水平均有不同程度的升高，可有效改善腎小球的濾過功能，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，使用當(dāng)歸補(bǔ)血煎劑與丸劑對(duì)MN大鼠血清BUN和CRE水平的影響差異不明顯，但使用這兩者均明顯高于使用顆粒劑和口服液的血清CRE水平。

綜上可知，不同當(dāng)歸補(bǔ)血制劑均有治療MN的作用，但當(dāng)歸補(bǔ)血湯煎劑和丸劑的治療效果優(yōu)于當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒配方和口服液。