吉林地區非結核分枝桿菌菌種鑒定情況分析

高菲?周亞麗

摘? 要：目的? 了解吉林地區非結核分枝桿菌（NTM）病的確診率及各菌種所占比例、地域性特點及分布情況，對本地區NTM病的診斷、治療和整體防治規劃起到至關重要的作用。方法? 采集2017～2019年吉林地區的NTM菌株3768株，采用分枝桿菌基因組快速提取試劑盒和獵陣分枝桿菌（16種）菌種鑒定試劑盒（膜芯片法），對NTM進行基因分型，鑒定到分枝桿菌種屬，以便臨床醫生對患者更合理用藥進行治療，避免耽誤最佳治療時期。結果? 2017～2019年吉林地區NTM病確診率分別為0.68/10萬、0.86/10萬、1.19/10萬;在3768株分枝桿菌中，NTM病所占比例為2.68%（101/3768）;將101例NTM病的菌株進行菌型鑒定，占比最多的是胞內分枝桿菌，為40.59%（41/101），其次為堪薩斯分枝桿菌，為26.73%（27/101）;地域分布：2017～2019年農村的確診率為3.23/10萬，城市的確診率為1.55/10萬;年齡分布：60歲以上NTM病患者占72.3%（73/101）。結論? 吉林地區NTM病確診率近幾年呈上升趨勢，地域性分布特點為農村高于城市;感染人群以老年人居多，本地區NTM病致病菌以胞內分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌為主。

關鍵詞：非結核分枝桿菌;菌種鑒定;PCR分子生物學技術

中圖分類號：R446.5 文獻標識碼：A 文章編號：1009-8011（2022）-11-00-03

非結核分枝桿菌（NTM）是指除結核分枝桿菌復合群（包括人型分枝桿菌、牛型分枝桿菌、非洲型分枝桿菌、田鼠型分枝桿菌）和麻風分枝桿菌以外的其他分枝桿菌[1]。近年來，NTM病呈快速增多趨勢，并且已經成為威脅人類健康的重要公共衛生問題。為應對NTM病日益增多的形勢，提高對NTM病的診斷治療和整體預防控制水平，減少NTM對人類生命健康的威脅。中華醫學會結核病學分會于2012年撰寫了《非結核分枝桿菌病診斷與治療專家共識》，詳細介紹了世界各國NTM病的發病情況和流行趨勢。我國近年來尚未有大樣本NTM病的流行病學調查資料。1990年和2000年全國結核病抽樣流調結果顯示，NTM分別為4.9%和11.1%，在發現的NTM中具有致病性的就有30余種，我國沿海地區的NTM發病率要遠遠高于內陸地區，并且致病的NTM種類也不相同[2]。了解本地區NTM病的確診率及各菌種所占比例及流行趨勢情況，并對患者信息進行統計和分析，得出相應結論，對本地區NTM病的診斷、治療、預防控制及防治規劃的制定起到至關重要的作用。本研究對吉林地區2017～2019年全部分枝桿菌培養陽性菌株（3768株）進行鑒定、基因分型，鑒定到分枝桿菌種屬。現報道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

收集吉林地區2017～2019年保留的分枝桿菌培養陽性菌株，共3768株（來源包括吉林地區9個縣市區結防所、吉林市結核病防治研究所全部結核網報患者培養陽性菌株），用傳統方法進行菌種鑒定，同時采用結核分枝桿菌基因組快速提取試劑盒和獵陣分枝桿菌（16種）菌種鑒定試劑盒，進行基因分型實驗，鑒定NTM到分枝桿菌種屬。

1.2? 實驗方法

（1）結核分枝桿菌基因組快速提取。吸取1 mL已滅菌的菌液加入到裂解管中離心5 min;吸棄上清（吸棄玻璃珠層以上液體，吸棄液體時不要碰到玻璃珠）;在裂解管中加入100 uL裂解液TF（TF每次使用時要搖勻并即刻取用）;恒溫振蕩儀上水平振蕩10 min，95 ℃;離心3 min，上清即為分枝桿菌提取的基因組，可作為聚合酶連反應（PCR）擴增模板。2～8 ℃保存。（2）獵陣分枝桿菌（16種）菌種鑒定。①PCR擴增：擴增體系為20 uL，即將17 uL擴增反應液和3 uL模版DNA分別加入PCR管中，渦旋離心數秒備用。擴增程序為50 ℃、2 min;95 ℃、4 min;（94 ℃、30 s，53 ℃、45 s，72 ℃、20 s）、35個循環;（94 ℃、30 s，68 ℃、45 s，72 ℃、20 s）、20個循環;4 ℃，hold。完成擴增反應后，PCR產物可立即檢測，如果不能立即檢測則置于-18 ℃以下保存，并且在1周內完成檢測。②分枝桿菌菌種鑒定膜芯片檢測：按照儀器及試劑盒說明書進行操作。（3）判讀分枝桿菌的種類。當膜芯片上2條陽性質控（HC、PC）探針均為陽性，陰性質控（NC）探針陰性時，認定本次結果有效。然后將各菌種鑒定探針的顯色斑點位置的結果與表1進行比對。結果判讀見表1。

1.3? 觀察指標

當膜芯片上HC、PC探針位置正常顯色，且NC探針位置為陰性時，根據膜芯片上顯色斑點的位置，讀取相應的檢測結果。若NTM探針出現顯色位點，NTM菌種鑒定探針同時出現顯色點，則說明為相應的NTM為陽性。例如：膜芯片上HC、PC探針位置正常顯色，NC探針位置為陰性時，NTM探針位置出現顯色斑點，同時，堪薩斯分枝桿菌探針位置也出現顯色斑點，則可以判定，該NTM菌種鑒定為堪薩斯分枝桿菌。若NTM探針出現顯色斑點，NTM菌種鑒定探針位置沒有出現顯色斑點，則說明可能為檢測范圍外的其他分枝桿菌。例如：膜芯片上HC、PC探針位置正常顯色，NC探針位置為陰性時，NTM探針位置出現顯色斑點，而NTM菌種鑒定探針沒有出現顯色斑點，則可以判定該患者感染了NTM，并且是檢測范圍外的其他分支桿菌。若結核分枝桿菌（MTB）探針出現顯色位點，則說明結核分枝桿菌復合群陽性。即膜芯片上HC、PC探針位置正常顯色，NC探針位置為陰性時，MTB探針位置出現顯色斑點，則可以判定該患者感染了MTB。若菌種鑒定探針出現多個顯色位點，則說明為多種分枝桿菌陽性。例如：膜芯片上HC、PC探針位置正常顯色，NC探針位置為陰性時，MTB探針位置出現顯色斑點，同時，NTM探針位置出現顯色斑點，并且胞內分枝桿菌探針位置也出現顯色斑點，則可以判定該患者混合感染了MTB和NTM，并且該NTM菌種鑒定為胞內分枝桿菌。通過肉眼判讀膜芯片上的顯色斑點位置，判定NTM菌種類型，分別統計數量，計算出吉林地區NTM病的確診率及各菌種類型所占比例，并且對患者信息進行統計分析，得出NTM病的地域分布情況及年齡結構情況。

2? 結果

2017～2019年吉林地區分離培養陽性菌株3768株，對所有分離培養陽性菌株同時進行傳統方法菌型鑒定和PCR分子生物學技術（分枝桿菌菌種鑒定膜芯片法）的菌種鑒定，傳統方法菌型鑒定出的MTB株數為3661株，NTM株數為100株，實驗污染為7株;PCR分子生物學技術鑒定出的MTB株數為3772株，NTM株數為101株，其中5株菌株利用分子生物學方法檢測MTB和NTM都存在。經重復試驗，判定這5株菌株為MTB和NTM混合感染，傳統方法菌型鑒定與PCR分子生物學技術鑒定具有較高的一致性。

將3768株菌株，經過分枝桿菌菌種鑒定膜芯片檢測進行菌型鑒定后，NTM株數為101株，在全部分枝桿菌中，NTM所占比例為2.68%（101/3768），按照年份統計，2017年25例、2018年32例、2019年44例，按照吉林地區人口370萬、分離出NTM菌株的人數計算（NTM病確診率=NTM病培養陽性人數/總人口數×100000/10萬），2017～2019年吉林地區NTM病確診率分別為0.68/10萬、0.86/10萬、1.19/10萬。對比分析得出，2017～2019年吉林地區NTM病的確診率呈逐年上升趨勢。

在101株NTM菌株中，胞內分枝桿菌為41株，所占比例為40.59%（41/101）;堪薩斯分枝桿菌為27株，所占比例為26.73%（27/101）;鳥型分枝桿菌5株，所占比例為4.95%（5/101）;恥垢分枝桿菌和膿腫分枝桿菌均為4株，所占比例均為3.96%（4/101）;偶然分支桿菌和次要分枝桿菌均為2株，所占比例均為1.99%（2/101）;其他NTM（膜芯片法檢測范圍以外的其他分枝桿菌）為16株，所占比例為15.84%（16/101）。其中5例為混合感染菌株，4例為人型分枝桿菌與胞內分枝桿菌混合感染，1例為人型分枝桿菌與膿腫分枝桿菌混合感染。

將101例NTM病患者的信息進行統計，地域分布：2017～2019年農村確診率為3.23/10萬（84例患者，260萬人口），城市確診率為1.55/10萬（17例患者，110萬人口），吉林地區NTM病的地域性分布特點為農村人口確診率高于城市人口確診率;年齡分布：60歲以上73例，40～59歲22例，40歲以下6例，吉林地區NTM病感染人群是老年人多于年輕人。

3? 討論

由NTM感染導致的疾病統稱NTM病，NTM病與結核病有相同或高度相近的病原菌形態、臨床特點、病理和影像特點，在結核病高負擔國家，NTM病誤診成結核病屢見不鮮[3]，甚至因治療效果不佳歸類于耐藥結核病或致多系統傳播性感染[4-5]。當患者出現抗結核治療效果差，反復抗酸桿菌檢測陽性時，醫生要考慮是NTM的感染，應該對標本進行分子生物學方法檢測[6-8]。

2017～2019年吉林地區NTM病確診率分別為0.68/10萬、0.86/10萬、1.19/10萬。目前NTM病是以NTM培養陽性為臨床診斷標準，NTM培養陽性患者為確診患者[1，9]。吉林地區NTM病的確診率呈逐年上升趨勢，分析原因：臨床醫生對NTM病的認識提高;實驗方法的改進和新技術的應用，尤其是PCR檢測技術應用于菌種鑒定，大大提高檢出率;以及高齡人群、艾滋病患者等易感人群的增多使NTM病確診率有所升高[10]。地域不同，NTM菌株流行分布特點不同。我國不同地區的相關研究結果顯示，常見的致病性NTM為鳥-胞

內分枝桿菌復合體、膿腫分支桿菌、堪薩斯分枝桿菌[11-12]。有研究顯示，我國北方是NTM病的多發地區，最常見NTM為胞內分枝桿菌[13]。本研究中的101株NTM，最多的是胞內分枝桿菌，比例為40.59%，其次為堪薩斯分枝桿菌，比例為26.73%，與我國北方菌株流行分布特點一致。對NTM病患者信息進行統計，吉林地區NTM病的地域性分布特點為農村發病率高于城市，其原因可能與生活習慣、自然環境及飲用水有關，使農村人口在NTM環境中的暴露機會遠大于城市人口。NTM病感染人群是以60歲以上的老年人為主，主要是老年人既往有慢性疾病者偏多，或長期應用激素致使機體抵抗力下降，導致一部分條件致病菌感染致病。

關于NTM病的治療，以胞內分枝桿菌病的治療為例，大多數一線抗結核藥物，比如異煙肼和吡嗪酰胺，對胞內分枝桿菌都天然耐藥，藥物對胞內分枝桿菌的體外活性比對結核分枝桿菌的體外活性降低10～100倍，而大環內酯類藥物（克拉霉素和阿奇霉素）卻是胞內分枝桿菌治療中不可替代的藥物，是胞內分枝桿菌病治療的核心藥物[14-15]。2020年新版胞內分支桿菌屬肺病診療指南[16]推薦，初治患者采用“克拉霉素+利福霉素+乙胺丁醇”三藥聯合方案，對于進展性、難治性的耐藥患者可酌情增加氨基糖苷類藥物。也有研究顯示莫西沙星是抗胞內分枝桿菌屬作用最強的氟喹諾酮類藥物[17]。NTM病的治療要遵循的重要原則是要在NTM菌種鑒定基礎上選擇合理的治療方案，做到不同的NTM病應給予不同的治療方案。

綜上所述，在重點人群中及時篩查診斷，選擇適當治療方案是降低NTM對高危人群健康危害的最有效手段。因此，鑒別MTB和NTM，并對NTM進行菌型鑒定，指導臨床醫生做出準確的診斷，避免耽誤最佳治療時期，對NTM病患者給予準確治療方案減輕負擔，以及對NTM病的防治規劃制定都起到至關重要的作用。

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