接種高溫嗜熱菌劑加快牛糞秸稈堆肥發(fā)酵進(jìn)程

李再興，馬 駿，武肖莎，黃亞麗，秦 學(xué)，滕志楠，趙 凱，張 凡

（1 河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2 河北省污染防治生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050018；3 河北昊源環(huán)境工程有限公司，河北石家莊 050011；4 河北省農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心，河北石家莊 050049）

目前我國(guó)每年畜禽糞污總產(chǎn)生量已達(dá)到38億t，其中80%以上來(lái)源于規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)[1]。由于規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖場(chǎng)與種植業(yè)在距離和養(yǎng)分供需上都存在脫節(jié)，造成畜禽糞污資源化利用效率低。高溫堆肥技術(shù)以穩(wěn)定化、腐殖化和無(wú)害化為目標(biāo)，是實(shí)現(xiàn)畜禽糞便資源化利用重要的手段之一[2-3]。然而，這一技術(shù)的高溫堆肥工藝(50℃～60℃)存在木質(zhì)纖維素降解難、發(fā)酵周期長(zhǎng)、氮素?fù)p失大、堆肥腐熟度低、無(wú)害化不徹底等問(wèn)題，這不僅降低堆肥產(chǎn)品的價(jià)值，還會(huì)滋生惡臭與滲濾液污染[4]。此外，傳統(tǒng)的高溫堆肥技術(shù)也已不能滿足日益增長(zhǎng)的畜禽糞污處理的需求以及堆肥產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)的要求，因此，亟需突破傳統(tǒng)高溫堆肥的技術(shù)壁壘。

超高溫堆肥即在傳統(tǒng)的好氧堆肥的基礎(chǔ)上，在不依賴外源加熱情況下，通過(guò)接種含有極端嗜熱微生物的微生物菌劑，使堆體的溫度迅速達(dá)到80℃以上并持續(xù)5～7天的好氧發(fā)酵過(guò)程[5-6]。提高堆肥溫度可有效降低木質(zhì)纖維素類(lèi)難降解有機(jī)物的結(jié)晶度，促進(jìn)有機(jī)質(zhì)降解，從而加速堆肥腐殖化進(jìn)程，縮短發(fā)酵周期[7-8]。研究表明，大部分難降解木質(zhì)纖維素類(lèi)物質(zhì)是在堆肥高溫期由嗜熱細(xì)菌和真菌降解的。因此，接種專(zhuān)用于超高溫堆肥的微生物菌劑是實(shí)現(xiàn)畜禽糞便超高溫堆肥的重要手段之一。同時(shí)，較高的溫度并且維持時(shí)間長(zhǎng)，有利于殺死大部分致病菌、病毒，增強(qiáng)抗生素及抗性基因的去除，使得堆肥無(wú)害化程度更徹底[9]。劉曉明等[10]指出在污泥超高溫堆肥過(guò)程中，水溶性有機(jī)物(DOM)的芳香化和腐殖化程度逐漸增強(qiáng)。廖漢鵬等[11]在污泥堆肥發(fā)酵中接種了極端嗜熱微生物菌劑，使得污泥自發(fā)熱，堆體溫度上升至80℃以上，將堆肥周期縮短至20天左右。崔鵬等[12]研究表明，超高溫堆肥技術(shù)顯著提高微生物能量代謝、碳水化合物代謝等產(chǎn)熱相關(guān)代謝通路豐度，增加有氧呼吸鏈相關(guān)功能基因豐度，在氧化亞氮減排、氮素保留、抗性基因去除等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。Yu等[13]研究表明，相比于傳統(tǒng)的高溫堆肥，超高溫堆肥可降解類(lèi)蛋白質(zhì)，同時(shí)增加腐殖質(zhì)的生成，腐殖化更加迅速。

超高溫堆肥技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要高溫嗜熱菌劑的支持。基于此，本研究擬在堆肥中接種由本課題組研發(fā)的高溫嗜熱菌劑，通過(guò)監(jiān)測(cè)堆肥的溫度、含水率、pH、電導(dǎo)率(EC)值、種子發(fā)芽率指數(shù)(GI)、木質(zhì)纖維素降解、細(xì)菌豐度等參數(shù)，探究該菌劑在牛糞＋玉米秸稈堆肥發(fā)酵中的效果，以期為促進(jìn)畜禽糞便快速腐熟，提升堆肥產(chǎn)品質(zhì)量提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的牛糞取自河北省石家莊市元氏康順奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的新鮮糞便，玉米秸稈取自當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶，粉碎為≤5 cm小段。牛糞和玉米秸稈的理化性質(zhì)見(jiàn)表1。本試驗(yàn)所用的GLL菌劑由本課題組所篩選的在高溫下可以正常生長(zhǎng)并分泌纖維素酶的嗜熱菌種進(jìn)行組配，包括普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)G1、地尿素芽孢桿菌(Ureibacillus terrenus) L2、嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrificans) L8，其中菌株G1∶L2∶L8混合比例為1∶4∶3。GLL菌劑的有效活菌數(shù)為 3×108CFU/mL，符合 GB20287—2006[14]的規(guī)定。市售菌劑A為河南省態(tài)沐生物科技有限公司生產(chǎn)的有機(jī)肥發(fā)酵劑，主要菌種包括酵母菌、芽孢桿菌等；市售菌劑B為山東貝佳生物科技有限公司生產(chǎn)的有機(jī)肥發(fā)酵菌劑，主要菌種包括芽孢桿菌、放線菌、酵母菌、木霉菌、固氮菌、乳酸菌等。

表1 堆肥原料理化性質(zhì)Table 1 Physico-chemical properties of raw materials for composting

堆肥試驗(yàn)裝置為具有保溫層的70 L發(fā)酵罐，發(fā)酵罐底部連接氣體流量計(jì)的曝氣裝置，發(fā)酵罐的上、中、下層分別設(shè)有溫度探頭，連接自動(dòng)記錄儀對(duì)溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

堆肥試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，不加菌劑對(duì)照(CK)、添加GLL菌劑(GLL)、添加市售菌劑A (A)、添加市售菌劑B (B)，所有處理堆肥原料配比均為30 kg牛糞+8 kg玉米秸稈，除CK外，其他3個(gè)處理的菌劑添加量均為3‰。堆肥發(fā)酵過(guò)程中，控制曝氣速度為7 L/min，發(fā)酵周期為30天。分別在堆肥第0、3、7、12、16、23、30天取樣，樣品共分為3份：一份烘干、粉碎及過(guò)篩后，測(cè)定堆肥樣品的木質(zhì)纖維素含量；一份鮮樣4℃冷藏保存，制取堆肥水浸提液，測(cè)定含水率、pH、EC值和種子發(fā)芽率指數(shù)(GI)等；一份鮮樣-80℃冷凍保存，用于測(cè)定細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

1.3 檢測(cè)項(xiàng)目及方法

堆肥發(fā)酵期間的溫度由自動(dòng)記錄儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。含水率采用105℃烘干法測(cè)定。pH和電導(dǎo)率(EC)以肥水質(zhì)量比1∶5浸提，pH采用酸度計(jì)測(cè)定，EC值采用電導(dǎo)率測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。種子發(fā)芽率指數(shù)(GI)參考文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定并計(jì)算，GI=(堆肥處理種子發(fā)芽率×種子根長(zhǎng))/(蒸餾水處理的種子發(fā)芽率×種子根長(zhǎng))×100%。纖維素、半纖維素、中性洗滌纖維(NDF)以及木質(zhì)素的含量采用ANKOM 2000i全自動(dòng)纖維測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。細(xì)菌豐度由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)定。堆肥產(chǎn)物有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、總養(yǎng)分、水分、酸堿度、GI值以及機(jī)械雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定方法參照NY/T 525—2021[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2017、IBM SPSS Statistics 26和Origin2018 64bit等軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度

堆肥溫度的高低顯著影響著發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)質(zhì)的分解和微生物群落的演替，也是檢驗(yàn)添加GLL菌劑是否能夠?qū)崿F(xiàn)超高溫堆肥以及快速殺死堆肥中有害微生物的重要指標(biāo)[17]。由堆肥發(fā)酵過(guò)程溫度的變化(圖1)可知，CK、A、B處理在堆肥第3天進(jìn)入高溫期(56.3℃、59.2℃、57.6℃)，CK、A、B處理的高溫階段分別持續(xù)了10、11、13天，各處理高溫的平均溫度和持續(xù)時(shí)間均符合畜禽糞便無(wú)害化的要求[18]。相較CK處理，A和B處理在發(fā)酵過(guò)程中的溫度上升更迅速，高溫期也更長(zhǎng)，但是兩者均未實(shí)現(xiàn)超高溫堆肥。這是由于市售菌劑的微生物多為中高溫菌株，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，菌株的活性便急劇下降，導(dǎo)致堆體溫度維持原狀甚至下降。相反，GLL處理在堆肥第2天內(nèi)迅速升溫至85.8℃，標(biāo)志著堆體進(jìn)入超高溫階段(≥80℃)[5-6]，超高溫期持續(xù)了5天，高溫期又持續(xù)到第18天。研究發(fā)現(xiàn)，堆肥積溫提高可縮短發(fā)酵周期[19-20]，由于GLL處理的堆體溫度高，有機(jī)質(zhì)降解反應(yīng)更為劇烈，有利于縮短堆體的發(fā)酵周期，加快有機(jī)質(zhì)降解。

圖1 接種不同菌劑堆肥過(guò)程中的溫度變化Fig. 1 Temperature changes during composting as affected by agent inoculation

2.2 含水率

堆肥過(guò)程中物料的含水率控制在50%～70%更有利于微生物的活動(dòng)[21]。由圖2可知，堆肥發(fā)酵期間，CK、A、B、GLL處理的堆體最初含水率分別為65.3%、66.3%、66.0%、66.7%，隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。在堆肥第16天，GLL處理的堆體含水率為44.3%，而CK、A、B處理的堆體含水率分別為50.2%、48.7%、47.3%。GLL處理的堆體含水率下降速率明顯高于CK、A、B處理，因?yàn)镚LL處理的堆體溫度明顯高于其他處理，更有利于水分的蒸發(fā)。堆肥結(jié)束時(shí)，CK、A、B處理的含水率分別為45.4%、43.8%、44.6%，A、B處理的堆肥含水率與CK沒(méi)有顯著差異，而GLL處理的含水率為34.3%，顯著低于CK和A、B處理，表明接種GLL高溫嗜熱菌劑實(shí)現(xiàn)的超高溫堆肥也促進(jìn)了堆肥含水率的下降。

圖2 接種不同菌劑堆肥過(guò)程中含水率變化Fig. 2 Changes in moisture content during composting as affected by agent inoculation

2.3 pH和EC值

堆肥pH影響著堆肥微生物的代謝活動(dòng)，也影響著堆肥過(guò)程氨的揮發(fā)[22]。從圖3中可以看出，CK、A、B和GLL處理的pH在整體上呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，這是由于隨著堆肥的進(jìn)行，堆肥原料中的蛋白質(zhì)發(fā)生脫氨基作用，氨氣的釋放會(huì)提高pH[23]。在堆肥發(fā)酵過(guò)程中，不同處理的pH差異不明顯，說(shuō)明添加外源菌劑不會(huì)影響堆肥的pH。Cui等[24]研究發(fā)現(xiàn)超高溫反而有助于氮素的保留。堆肥末期，各處理的pH趨于穩(wěn)定，CK、A、B、GLL處理的pH均在8.0～9.0。

圖3 接種不同菌劑堆肥過(guò)程中pH和EC值變化Fig. 3 Changes in pH and EC value during composting as affected by agent inoculation

堆肥EC值反映著堆肥產(chǎn)物的植物安全性。EC值的變化與有機(jī)質(zhì)的礦化和腐殖化過(guò)程相關(guān)。4個(gè)處理的EC值均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，CK、A處理EC峰值出現(xiàn)在堆肥第16天，B、GLL處理出現(xiàn)在堆肥第7天。堆肥結(jié)束后，CK、A、B、GLL處理的EC值分別為2.13、1.99、2.03、1.95 μS/cm，菌劑的添加導(dǎo)致堆肥EC值下降。

2.4 種子發(fā)芽率指數(shù)(GI值)

種子發(fā)芽率指數(shù)(GI值)是評(píng)價(jià)堆肥腐熟度和表征安全性的一個(gè)主要生物指標(biāo)，一般堆肥的GI值必需超過(guò)80%[25-26]。由堆肥過(guò)程中的GI值的變化(圖4)，可知，CK、A、B、GLL處理的GI值均隨發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中GLL處理GI值的上升最為迅速，在堆肥的第16天，GI值已經(jīng)達(dá)到80%以上，而CK、A、B處理分別需要30、23、23天才能達(dá)到80%以上。因此，接種GLL菌劑可以加快堆肥的腐殖化進(jìn)程，有效縮短發(fā)酵周期7～14天。

圖4 接種不同菌劑堆肥過(guò)程中GI變化Fig. 4 Changes in GI during composting as affected by agent inoculation

2.5 木質(zhì)纖維素的變化

木質(zhì)纖維素的降解體現(xiàn)了堆肥的穩(wěn)定化和腐殖化進(jìn)程。木質(zhì)纖維素包括半纖維素、纖維素、木質(zhì)素等。圖5顯示，在堆肥發(fā)酵過(guò)程中，各處理的牛糞+秸稈混合物料的木質(zhì)纖維素含量均逐漸降低，降解率逐漸增加。纖維素、木質(zhì)素的降解主要發(fā)生在堆肥高溫期。在堆肥發(fā)酵第7、30天時(shí)，A、B、GLL處理的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解率較CK處理顯著增加，尤其是GLL處理的木質(zhì)纖維素降解更為顯著，這說(shuō)明提高堆肥溫度有助于纖維素類(lèi)和木質(zhì)素的降解。牛明杰等[27]研究發(fā)現(xiàn)，半纖維素的主要降解階段為堆肥穩(wěn)定期，堆肥結(jié)束時(shí)降低了38.8%，纖維素和木質(zhì)素僅在堆肥高溫期有少量降解，分別降解了11.7%和18.5%。吳耀領(lǐng)等[28]從丟棄酒糟中篩選到3株纖維素降解菌MM2、MM6和MX8，并按照1∶1∶1復(fù)配復(fù)合菌劑，研究發(fā)現(xiàn)3種不同復(fù)合菌劑接種量(0.6%、0.8%、1.0%)酒糟中的纖維素分別降解了28.6%、34.8%和37.0%，對(duì)照組纖維素僅降解了18.0%，接種復(fù)合菌劑明顯促進(jìn)酒糟堆肥腐熟和縮短堆肥周期。堆肥發(fā)酵后，GLL處理堆肥后的木質(zhì)纖維素含量比堆肥初始值下降了70.7%，下降幅度明顯高于CK、A、B處理，半纖維素、纖維素和木質(zhì)素含量在堆肥后分別下降81.6%、65.2%和53.7%。高華等[29]研究發(fā)現(xiàn)加入微生物菌劑可明顯提高堆肥過(guò)程脫氫酶的活性，有利于纖維素等有機(jī)質(zhì)的氧化降解。因此，在堆肥中添加嗜熱GLL菌劑可能通過(guò)提高脫氫酶的活性，從而提高了木質(zhì)纖維素的降解效率。

圖5 接種不同菌劑堆肥過(guò)程中木質(zhì)纖維素的變化Fig. 5 Changes in lignocellulose during composting as affected by agent inoculation

2.6 細(xì)菌豐度

為探究在超高溫堆肥過(guò)程中細(xì)菌群落的變化，對(duì)GLL處理堆肥前7天的細(xì)菌群落在門(mén)水平上相對(duì)豐度的變化進(jìn)行分析。從圖6可以看出，超高溫堆肥過(guò)程中，在堆肥第0、3、7天的細(xì)菌群落之間有著巨大的差異。堆肥第0天，細(xì)菌群落主要有厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)以及擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)，其中，變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是主要的菌門(mén)，共占細(xì)菌總序列的68.4%。隨著堆肥進(jìn)入高溫及超高溫期，變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)占總序列的比例分別減少到8.5%、14.4%，厚壁菌門(mén)占總序列的比例逐漸增加到46.6%。厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)是降解木質(zhì)纖維素的主要細(xì)菌菌群[30-31]。接種GLL處理的堆體在發(fā)酵的第2天溫度就升至85.8℃，且持續(xù)5天，堆肥第3～7天厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度的增加說(shuō)明其可耐受超高溫，高溫期纖維素的降解主要是由厚壁菌門(mén)完成的，同時(shí)釋放熱量將堆體推向更高的溫度，提高堆肥產(chǎn)物的質(zhì)量。李瑋琳等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在堆肥早期和中期(0～10天)，添加菌劑可提高堆肥中的厚壁菌門(mén)(Firmicutes)相對(duì)豐度，從而提高木質(zhì)纖維素等難降解有機(jī)質(zhì)的降解。李昌寧等[19]研究表明，在堆肥的高溫期，未接種菌劑的傳統(tǒng)高溫堆肥中厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度僅為17.4%，遠(yuǎn)小于本研究接種GLL菌劑的堆肥處理在高溫期厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度(46.6%)。因此，在堆肥過(guò)程中接種GLL菌劑可能通過(guò)提高堆肥發(fā)酵過(guò)程中厚壁菌門(mén)等優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落的豐度，促進(jìn)堆體升溫并延長(zhǎng)高溫時(shí)期，進(jìn)而有效提高木質(zhì)纖維素的降解能力，縮短堆肥的腐熟周期。

圖6 接種GLL菌劑不同時(shí)間堆肥中門(mén)水平細(xì)菌的相對(duì)豐度Fig. 6 The relative abundance of bacteria at phylum in different time of composting with GLL inoculation

2.7 堆肥產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)

參照NY/T 525—2021[16]農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)有機(jī)肥料的要求，檢測(cè)了接種GLL菌劑超高溫堆肥發(fā)酵后堆肥產(chǎn)物的有機(jī)質(zhì)、總養(yǎng)分、水分和機(jī)械雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及酸堿度、GI值(表2)。超高溫堆肥后，堆肥產(chǎn)物的有機(jī)質(zhì)、總養(yǎng)分和機(jī)械雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酸堿度、GI值均滿足NY/T 525—2021[16]的要求，含水率略高于該標(biāo)準(zhǔn)的要求。因此，超高溫堆肥對(duì)畜禽廢棄物的無(wú)害化效果良好，基本滿足了NY/T 525—2021[16]中的要求。

表2 接種GLL堆肥產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果Table 2 Testing results of compost products inoculated with GLL

3 結(jié)論

接種GLL菌劑處理可在堆肥第2天達(dá)到超高溫(85.8℃)，而其他菌劑只能達(dá)到高溫，較傳統(tǒng)堆肥該階段較高的高溫嗜熱菌厚壁菌門(mén)(46.6%)的相對(duì)豐度十分有利于堆肥材料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的分解，促進(jìn)了水分的蒸發(fā)以及有害微生物的消除，因而，其GI值在堆肥的第16天就超過(guò)80%，在堆肥30天產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到堆肥產(chǎn)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)NY/T 525—2021的要求，較傳統(tǒng)堆肥和接種普通菌劑大大縮短了堆肥周期，提高堆肥發(fā)酵效率。