金線蓮干預2型糖尿病的“關鍵成分-潛在靶標-核心通路”網絡挖掘及實驗驗證

朱 菲，吳 梅，孔向軍*，方 莉，馬巧群，陶 益*

1.浙江工業大學藥學院，浙江 杭州 310014

2.金華市農業科學研究院，浙江 金華 321000

3.金華匠康金草生態農業科技有限公司，浙江 金華 321000

糖尿病是一種以血糖升高和代謝紊亂為主要特征的疾病，屬中醫學“消渴病”范疇。其中2型糖尿病占所有糖尿病患者的95%左右，嚴重威脅人類健康[1]。2型糖尿病又稱為非胰島素依賴型糖尿病，多發于肥胖及中老年人群，患者體內胰島素分泌相對不足或作用效果不佳。2型糖尿病可誘發多種并發癥，包括糖尿病心血管疾病、糖尿病肝病、糖尿病腎病等。臨床上治療2型糖尿病一般分為注射胰島素和口服降糖藥2種方案。然而，這2種方案的持續治療通常會導致耐藥性和明顯的不良反應，甚至可引起多種心臟毒性、神經毒性等損害患者身體健康[2-3]。中藥及其有效成分在2型糖尿病的防治中具有療效穩定、不良反應少、可長期使用、通過多靶標多途徑調節代謝紊亂，起到保護胰腺結構和功能的作用。因此，一些具有降血糖活性的中藥越來越受到人們的關注[4]。

金線蓮Anoectochilus roxburghii(Wall.) Lindl.是蘭科開唇蘭屬多年生草本藥用植物，營養成分豐富，在民間有“鳥人參”“藥之王”“神草”“金草”等美譽，是我國名貴的天然藥物[5]。近年來，金線蓮逐漸成為研究熱點[6]。研究表明，金線蓮具有多種生物活性，包括抗腫瘤[7-8]、保肝[9]、降血糖[10]、抗氧化[11]和免疫調節作用。目前，關于金線蓮用于治療2型糖尿病的具體作用機制尚未明確。網絡藥理學是通過將多元藥理學網絡映射到人類疾病-基因網絡上而建立起來的。該方法將揭示與疾病相關的一些重要藥物靶標。本研究首先通過文獻檢索的方式查找出金線蓮的化學成分信息，利用網絡藥理學構建有效成分-疾病-靶標網絡圖，并進行生物學功能分析，初步預測金線蓮干預2型糖尿病可能的信號通路和關鍵作用靶點。同時結合動物實驗，對網絡藥理學篩選出的關鍵作用靶標進行初步驗證，采用造模后給藥治療的方式，檢測預測的相關蛋白水平，評價金線蓮對2型糖尿病的干預效果，為金線蓮的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學分析

1.1.1 化學成分數據庫構建及靶標預測 本研究首先從PubChem和PubMed等數據庫中搜集金線蓮所含有的化學成分，建立金線蓮化學成分數據庫，使用ChemDraw18.0繪制化合物結構，獲取每個化學成分的SMILES構型，并對化學成分進行分類。通過Swiss Target Prediction數據庫和Similarity Ensemble Approach數據庫檢索每個化學成分的作用靶標。利用UniProt數據庫對化學成分的作用靶標的名稱進行標準化處理。

1.1.2 2型糖尿病作用靶標的查詢 GeneCards數據庫是人類基因數據庫，DisGeNET數據庫是綜合性的基因-疾病關聯關系數據庫。以“type 2 diabetes mellitus”為關鍵詞在GeneCards和DisGENET數據庫查找2型糖尿病相關的作用靶標，并刪除重復的靶標。為了獲得與2型糖尿病更加相關的靶標，將根據得分進行中位值的篩選并且采用UniProt數據庫對靶標進行規范化處理。

1.1.3 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建 利用Venny 2.1獲取金線蓮化學成分與2型糖尿病的共有靶標，并將其導入STRING數據庫和Cytoscape 3.8.0，構建可視化的PPI網絡圖。并將物種設定為“Homo sapiens”，可信度＞0.9。

1.1.4 拓撲分析與MCODE聚類分析 采用Cytoscape 3.8.0軟件構建“成分-靶標-通路-疾病”網絡圖，利用插件Network Analyzer進行拓撲分析，計算節點自由度、接近中心性等。通過度（degree）排序，選取分值大于2倍平均分的基因作為關鍵靶標，獲得金線蓮治療2型糖尿病的關鍵靶標及關鍵通路。通過插件MCODE進行基因簇的分析以及核心靶標的篩選。

1.1.5 基因本體（gene ontology，GO）富集分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集 為了闡明金線蓮在2型糖尿病治療中的作用機制，將金線蓮與2型糖尿病的共有基因導入DAVID 6.8數據庫，限定物種為“Homo Sapiens”，設定閾值P＜0.05，進行KEGG通路富集分析和GO生物過程富集分析。

1.2 實驗驗證

1.2.1 動物 選取SPF級6周齡的健康雄性SD大鼠36只，體質量200～220 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物合格證編號：SCXK（滬）2017-0005。將大鼠飼養在具有通風設備的飼養代謝籠中，控制溫度在25～28 ℃，濕度50%～60%，自由飲水和攝食。動物實驗經浙江工業大學倫理委員會批準（批準號20210429036）。

1.2.2 藥材 金線蓮由金華匠康金草生態農業科技有限公司提供，經浙江工業大學藥學院王平教授鑒定為蘭科植物金線蓮A.roxburghii(Wall.) Lindl.干燥全草。

1.2.3 藥品與試劑 鹽酸二甲雙胍片（0.5 g/片，國藥準字H20023370，批號ABW2015）購自中美上海施貴寶制藥有限公司；鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司，批號S0130-1g；檸檬酸鹽緩沖液購自福建飛凈生物科技有限公司，批號20210602；多聚甲醛購自上海麥克林生化科技有限公司，批號C10232385；高糖高脂飼料（基礎飼料58.8%、豬油20%、糖20%、膽固醇1%、膽鹽0.2%）購自南京盛民科研動物養殖場。ELISA檢測試劑盒均購自于赫澎（上海）生物科技有限公司，胰島素試劑盒批號為202109，靶標試劑盒批號均為202110。

1.2.4 儀器 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；超聲波清洗機（昆山式超聲儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；GA-3型血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；全自動生化分析儀LWC400（深圳藍韻醫療器械）；球磨儀（上海凈信科技有限公司）。

1.2.5 2型糖尿病模型的構建 高糖、高脂飼料飼養大鼠8周后，禁食12 h，除對照組外，其他各組大鼠ip 0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 4.5）配制的40 mg/kg鏈脲佐菌素，同時，對照組大鼠ip同等劑量0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.5）[11-13]。1周后禁食12 h，檢測空腹血糖（fasting blood sugar，FBG），若FBG連續2次≥11.1 mmol/L，同時伴有多飲、多食、多尿癥狀的大鼠，即視為造模成功。

1.2.6 溶液的配制

（1）金線蓮提取液的配制：取金線蓮干粉末（過60目篩）50 g，液料比為20∶1，提取溶劑為蒸餾水，于水浴100 ℃的條件下回流提取1 h，減壓抽濾并收集濾液[14]，重復以上步驟再提取1次，2次的濾液合并后于70 ℃的條件下減壓旋轉蒸發至222 mL，即為金線蓮高濃度提取液；提取液中、低濃度分別為高濃度提取液的1/2和1/4。金線蓮提取液直接ig給藥。通過HPLC-UV測定，金線蓮高濃度水提液中金線蓮苷、水仙苷、蘆丁、阿魏酸及山柰素質量分數分別為13.49%、0.30%、0.10%、0.04%和0.02%。

（2）陽性藥物的配制：將去除包衣的鹽酸二甲雙胍片投入球磨儀研磨成粉末，0.70 g鹽酸二甲雙胍粉末溶于80 mL蒸餾水中，振蕩搖勻，制成鹽酸二甲雙胍混懸液，儲存于4 ℃冰箱備用。

1.2.7 分組與給藥 健康雄性SD大鼠使用普通飼料適應性飼養1周后，分6個組，每組6只，分別為對照組、模型組、二甲雙胍（陽性對照，70 mg/kg）組及金線蓮高、中、低劑量組。金線蓮給藥劑量按照人臨床使用劑量0.071 4 g/kg換算為大鼠用量0.45 g/kg，此劑量為金線蓮低劑量組給藥量，金線蓮中、高劑量組給藥劑量分別為0.9、1.8 g/kg。造模成功后按照8 mL/kg的給藥體積連續ig 3周，對照組和模型組給予等量的生理鹽水，并于第7、14和21天稱體質量和測定FBG。在整個實驗周期內，每天觀察大鼠的基本狀況。

1.2.8 靶標的驗證 金線蓮干預3周后各組大鼠禁食不禁水過夜，ig 10%戊巴比妥鈉（3.5 mL/kg）進行麻醉[15]。鈍性分離腹主動脈后，用含肝素鈉抗凝劑的采血管采集血液，3000 r/min離心10 min，分離得到血清。按照相應ELISA試劑盒要求，檢測血清中各靶標的水平。

1.2.9 胰島素水平的測定 金線蓮干預3周后，取大鼠血清適量采用酶聯免疫法檢測胰島素水平。

1.2.10 病理學檢查 取胰腺組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，采用常規蘇木精-伊紅染色，在光學顯微鏡觀察并拍照分析。

1.2.11 統計學分析 應用SPSS 20.0統計學分析軟件進行數據處理，數據均以表示。組間比較滿足方差齊性時采用單因素方差分析，不滿足方差齊性時采用非參數檢驗，P＜0.05代表具有統計學差異。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析

2.1.1 PPI網絡的構建與分析 通過文獻數據庫收集整理共獲得金線蓮80種化學成分，其中黃酮類25個，有機酸和揮發性化合物25個，三萜類10個，生物堿和核苷類7個，甾體類7個，糖苷類化合物6個。通過Swiss Target Prediction數據庫和Similarity ensemble approach數據庫篩選獲得金線蓮化學成分860個靶標。利用GeneCards和DisGENET數據庫篩選獲得1323個2型糖尿病相關的基因。利用Venny 2.1得到249個共有靶標，見圖1。將得到的249個共同靶標導入STRING平臺構建PPI網絡圖，將生物種類設定為“Homo sapiens”，選取最低相互作用閾值大于0.9的靶標，得到PPI網絡圖，見圖2。該網絡圖中共有249個節點和989條邊，平均度值為7.94。

圖1 金線蓮與2型糖尿病靶標交集韋恩圖Fig.1 Venn diagram of targets of A.roxburghii and type 2 diabetic mellitus

圖2 金線蓮治療2型糖尿病靶標的PPI網絡圖Fig.2 PPI network diagram of A.roxburghii related type 2 diabetic mellitus targets

2.1.2 “化學成分-疾病-通路-靶標”網絡圖的構建 利用Cytoscape 3.8.0軟件繪制“化學成分-疾病-通路-靶標”網絡圖。如圖3所示，紫色為化學成分，粉色為2型糖尿病靶標，藍色為最顯著的前20條通路，紅色為疾病即2型糖尿病。通過Network Analyzer工具進行拓撲分析，通過度值排序，選取分值大于2倍平均分的基因作為關鍵靶標，總共篩選出32個關鍵靶標，前10個靶標如圖4所示。金線蓮對2型糖尿病治療作用主要與花生四烯酸-5-脂加氧酶（arachidonic acid-5-lipoxygenase，ALOX5）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、醛糖還原酶（aldose reductase，AR）、細胞色素P45019A1（cytochrome P45019A1，CYP19A1）、細胞色素 P4501B1（cytochrome P4501B1，CYP1B1）、蛋白酪氨酸磷酸酶-1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）、環氧化酶-2（cyclooxygenenase-2，COX-2）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）等作用靶標有關。對其進行網絡拓撲分析，節點度值排名前5的化合物如圖5所示，分別為槲皮素、異鼠李素、金線蓮苷、齊墩果酸和熊果酸，節點度較高的化合物是金線蓮發揮2型糖尿病治療作用的關鍵成分。

圖3 金線蓮“化學成分-疾病-通路-靶標”網絡圖Fig.3 Network diagram of “composition-disease-pathway-target ” of A.roxburghii

圖4 排名前10的靶標及其度值Fig.4 Top 10 targets and their degrees

圖5 排名前10的化合物及其度值Fig.5 Top 10 compounds and their degrees

2.1.3 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析將249個交集靶標導入DAVID 6.8數據庫，進行GO富集分析，篩選P＜0.05的條目，總共富集到349條生物過程相關、86條細胞組成相關和165條分子功能相關的條目。如圖6所示，生物學過程相關的條目主要包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、凋亡的負調控、蛋白質磷酸化、對藥物的反應、基因表達的正調控等。細胞組成相關的條目涉及細胞質膜、細胞質溶膠、胞外外泌體、細胞膜、細胞外間隙等。分子功能相關的條目主要集中于相同蛋白質結合、蛋白質同源二聚化活性、酶結合、蛋白質激酶活性、血紅素結合、蛋白酪氨酸激酶活性等方面。

圖6 GO功能富集分析Fig.6 GO function enrichment analysis

KEGG通路富集分析結果如圖7所示，具有顯著意義（P＜0.05）的通路共139條，主要與Ras信號通路、胰島素抵抗信號通路、低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF-1）信號通路、催乳素信號通路、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路和T細胞受體信號通路等方面有關。

圖7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis

2.2 實驗驗證

2.2.1 一般狀態觀察 糖尿病的典型癥狀包括多飲、多食和消瘦。造模后，與對照組相比，其他組大鼠飲水量和進食量明顯增加，懶動。給藥期間，金線蓮各劑量組飲水量較模型組減少，但比對照組增多；進食量較模型組減少，但與對照組相比增多；精神狀態較模型組大有好轉。各組間體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2.2 降血糖作用 血糖是衡量金線蓮對2型糖尿病大鼠治療作用的基礎指標。各組大鼠ig 3周后，利用血糖儀測定每只大鼠的FBG值。如圖8所示，模型組大鼠FBG平均值達到15.0 mmol/L，表明造模成功；與模型組大鼠相比，二甲雙胍組與金線蓮各劑量組大鼠FBG值均顯著下降（P＜0.05）。

圖8 給藥3周后各組大鼠FBG ()Fig.8 FBG of rats in each group three weeks after administration ()

2.2.3 胰島素水平 如圖9所示，ig 3周后，與對照組相比，模型組大鼠血清胰島素水平顯著性升高（P＜0.05）；與模型組相比，二甲雙胍組與金線蓮各劑量組大鼠胰島素水平均顯著下降（P＜0.05）。

圖9 給藥3周后各組大鼠血清胰島素水平 (±s , n=6)Fig.9 Serum insulin level of rats in each group three weeks after administration (±s , n=6)

2.2.4 胰腺組織病理學變化 如圖10所示，與對照組比較，模型組大鼠的胰腺細胞排列紊亂，腺泡分布松散，胰島細胞壞死明顯。然而在二甲雙胍組和金線蓮各劑量組治療3周后，胞漿均勻無空泡，胰島結構變得更為清晰且邊界清楚，細胞核較清晰，但胰島細胞輕微壞死，程度較對照組嚴重。

圖10 胰腺組織HE染色 (×200)Fig.10 HE staining of pancreatic tissues (× 200)

2.2.5 靶標的驗證 根據網絡藥理學的預測結果，金線蓮對2型糖尿病的治療作用與ALOX5、AChE、AR、CYP19A1、CYP1B1、PTP1B、COX-2及IL-2等靶標有關。為了驗證該預測結果，采用酶聯免疫法檢測大鼠血清中8種預測靶標水平，結果如圖11所示。與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-2、ALOX5、CYP1B1和CYP19A1水平均顯著降低（P＜0.05），而COX-2、PTP1B和AR水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組大鼠血清中IL-2、ALOX5、CYP1B1和CYP19A1水平均顯著升高（P＜0.05），AChE、COX-2和AR水平顯著降低（P＜0.05）。金線蓮低劑量組大鼠血清COX-2和PTP1B水平顯著降低（P＜0.05）；中劑量組大鼠血清IL-2、ALOX5、CYP1B1和CYP19A1水平顯著升高（P＜0.05），COX-2、PTP1B、AChE和AR水平顯著降低（P＜0.05）；高劑量組ALOX5、CYP1B1和CYP19A1水平顯著升高（P＜0.05），AChE水平顯著降低（P＜0.05）。

圖11 各組大鼠血清中8種靶標水平 (±s , n=6)Fig.11 Serum levels of eight targets of rat in each group (±s , n=6)

3 討論

2型糖尿病是一種以高血糖和胰島素抵抗為主要特征的復雜代謝紊亂疾病，對腎臟和肝臟等器官系統都有影響，嚴重威脅人類健康與壽命[16]。目前，2型糖尿病多發、高發且越來越年輕化，及早干預是降低并發癥和致死率的關鍵。中藥在2型糖尿病的治療方面有著顯著的療效和優勢，亟待守正創新和傳承發展。

網絡藥理學技術在藥物與疾病之間的關系研究以及疾病靶標和途徑的預測方面應用越來越多。在藥物設計和開發中，網絡藥理學不僅可以多維度地闡明藥物的作用機制、預測新的藥理作用的同時也可以降低藥物發現的成本[17-18]。通過網絡藥理學的預測發現，金線蓮治療2型糖尿病的關鍵活性成分為金線蓮苷、槲皮素、異鼠李素、齊墩果酸、熊果酸等。槲皮素具有促進胰腺干細胞再生和胰島細胞分化的作用，通過其抗氧化、抗炎和抗凋亡活性來保護胰腺細胞免受損傷，并調節與葡萄糖代謝相關的酶活性來降低血糖，增加對胰島素的敏感性[19-20]。異鼠李素的自由基清除活性，主要通過3種主要的抗氧化途徑實現：氫原子轉移、單電子轉移隨后質子轉移和順序質子丟失電子轉移[21]。金線蓮苷具有調節酶促抗氧化劑的活性、清除自由基和降低NO的含量，減少對胰島β細胞的刺激且改善其功能[22]。金線蓮苷通過調節基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-組織抑制劑金屬蛋白酶（tissue inhibitor metalloproteinase，TIMP）的平衡來維持血管結構的動態平衡，恢復血管內皮細胞結構，有利于生物活性物質的正常分泌[23]。熊果酸的化學結構為α-香樹脂醇型五環三萜類，可以將血糖酵解為其他糖代謝產物并且減少葡萄糖的吸收，可能的作用途徑為促進葡萄糖激酶mRNA表達、提高糖代謝關鍵酶葡萄糖激酶的含量和抑制α-葡萄糖苷酶活性等；保護胰腺β細胞并刺激胰島分泌胰島素；抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1β和激動胰島素受體TGR5，加快體內葡萄糖的攝取和利用速率[24-25]。齊墩果酸可以降低細胞內α-葡萄糖苷酶和α-胰腺淀粉酶的活性來調節外源葡萄糖的吸收，同時抑制糖原分解限速酶-糖原磷酸化酶的活性，減少內源性葡萄糖的生成和糖原的分解。除此之外，齊墩果酸還可以通過TGR5途徑刺激胰島β細胞釋放胰島素，從而起到改善胰島素抵抗的作用[26-27]。另有研究顯示，金線蓮多糖也具有降血糖作用[28]。

高血糖可促使細胞膜糖基化，破壞粒細胞結構，限制其免疫功能，吞噬殺菌力減低，延緩淋巴細胞的分裂，導致輔助性T細胞的減少。IL-2主要是由輔助性T細胞產生，高血糖導致IL-2分泌減少[29]。金線蓮各劑量組的血糖水平顯著下降，IL-2水平也回歸正常。PTP1B對胰島素傳導過程具有負調節作用。當發生胰島素抵抗時，PTP1B的表達水平顯著增強，促使胰島素受體及受體底物酪氨酸磷酸化，阻斷胰島素的降血糖作用[30]。金線蓮給藥后PTP1B水平恢復正常水平。ALOX5是花生四烯酸代謝途徑中的關鍵酶之一。研究表明，花生四烯酸具有降低糖尿病大鼠血糖、提高機體抗氧化能力的功效[31]。模型組大鼠ALOX5水平降低，花生四烯酸的分解代謝受到抑制，表明模型組大鼠體內花生四烯酸的代償性積累。金線蓮給藥后ALOX5水平恢復正常。COX-2作為炎癥反應的關鍵酶，過度表達能降低機體對胰島素的敏感性，減少胰島細胞對葡萄糖的利用[32]。金線蓮給藥后能顯著降低血清COX-2水平。AR是體內多元醇代謝途徑的主要酶，可以催化葡萄糖產生大量的山梨醇。由于山梨醇不易透過細胞膜，山梨醇在細胞間質大量堆積，這將對機體健康造成嚴重問題，如糖尿病和腎臟損傷等[33]。因此，抑制AR的活性可以減少山梨醇的產生，降低患糖尿病的風險。模型組的AR水平顯著升高，而金線蓮給藥后AR水平回歸正常。

2型糖尿病與氧化應激機制有著密不可分的關系。CYP1B1具有抑制內皮細胞氧化應激反應的作用。抑制CYP1B1的活性能降低氧化應激水平和阻礙c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）信號轉導，而JNK信號通路在氧化應激中是至關重要的[34]。模型組CYP1B1水平下降，而金線蓮給藥后CYP1B1水平恢復正常水平。糖代謝與CYP450酶家族基因的多態性密切相關。CYP19A1基因與性激素、雌激素以及芳香化酶的活性有關，其可能通過影響雌激素水平起到降血糖的作用[35]。模型組CYP19A1水平下降，而金線蓮給藥后恢復正常。

AChE具有誘導血管內皮細胞依賴性舒張的作用，然而AChE的過度表達可使血管內皮細胞受損。許多動物實驗證實胰島素抵抗與內皮細胞功能紊亂相關，當內皮細胞功能發生紊亂時，機體內游離脂肪酸水平升高，胰島素信號轉導通路受阻，胰島素無法及時對葡萄糖分解利用。模型組AChE 水平升高，而金線蓮給藥后AChE 水平恢復正常。

綜上所述，金線蓮可以通過減少炎癥信號通路關鍵酶的表達、改善胰島素抵抗從而發揮降血糖的作用，可用于開發抗糖尿病新藥。本研究體現了金線蓮多成分、多通路、多靶標的作用特征，對明確金線蓮治療2型糖尿病的作用機制具有重要意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突