基于藥物轉運體的小白菊內酯衍生物ACT001的跨膜轉運機制和耐藥性研究

孫英輝 ，尚海花，慈小燕, ，武衛黨 , ，王 澤，崔 濤 , ，曾 勇, ，閆鳳英 , ，伊秀林 ,

1.天津藥物研究院有限公司 生物技術中心，天津 300301

2.中國醫學科學院 藥物代謝新技術創新單元，天津 300301

3.北京協和醫學院&中國醫學科學院放射醫學研究所，天津市放射醫學與分子核醫學重點實驗室，天津 300192

4.天津和創生物技術有限公司，天津 300301

5.天津藥物研究院有限公司 釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室，天津 300301

6.天津中醫藥大學研究生院，天津 301617

銀膠菊屬銀膠菊Parthenium hysterophorusL.是一年生草本，具主根，徑直立，葉變化多樣，頭狀花序小，放射狀。民間多用銀膠菊治療偏頭痛、風濕病等。銀膠菊的乙醇提取物經萃取分離得到小白菊內酯。小白菊內酯（圖1-A）是一種倍半萜烯內酯類（sesquiterpene lactones，SLs）化合物[1]。研究表明，小白菊內酯具有明顯的抗腫瘤作用，對惡性膠質瘤、急性髓細胞白血病 、前列腺癌等多種癌癥具有治療作用[2-4]。然而，小白菊內酯水溶性較差，限制了其臨床研究和應用。小白菊內酯衍生物ACT001（圖1-B）為11βH,13-二甲基氨基含笑內酯的富馬酸鹽，母核為愈創木烷型倍半萜烯內酯。ACT001是一個抗腫瘤高活性化合物，現作為抗腦膠質瘤I類新藥正在進行臨床研究階段[5-7]。腦膠質瘤是膠質瘤的最惡性變體，約占所有固有腦瘤的一半。當前的治療方案為切除、放射治療合并化學治療[8-11]。但是，膠質瘤是浸潤式生長的，手術很難完全切除，迫切需要一種安全有效的藥物來治療腦膠質瘤。因此，ACT001作為抗腦膠質瘤I類新藥具有明顯的臨床價值和廣闊的應用前景。

圖1 小白菊內酯 (A) 和ACT001 (B) 的化學結構Fig.1 Chemical structures of parthenolide (A) and ACT001 (B)

藥物轉運體是一類存在于細胞膜上對藥物跨膜轉運起重要作用的膜蛋白，可分為攝入型轉運體和外排型轉運體。攝入型轉運體主要包括有機陽離子轉運體（organic cation transporters，OCTs）、有機陰離子轉運體（organic anion transporters，OATs）、有機陰離子轉運多肽（organic anion transport peptides，OATPs）等；外排型轉運體以P糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp，又名MDR1）和乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）為代表[12-13]。外排轉運體在血腦屏障、腸上皮細胞壁膜、肝和腎小管細胞中高表達，可調節藥物的吸收、分布和排泄等藥動學過程[14-15]，且與抗腫瘤藥物的耐藥性密切相關。

小白菊內酯衍生物ACT001作為抗腦膠質瘤I類新藥，目前尚未報道其與藥物轉運體作用的關系。本研究應用人藥物轉運體基因轉染細胞/囊泡、人結腸腺癌細胞（Caco-2、LS-180），較為全面地研究了ACT001對藥物轉運體的抑制作用、底物親和性和誘導作用，從藥物轉運體角度闡明了ACT001的跨膜轉運及可能發生的藥物-藥物相互作用和耐藥性。

1 材料

1.1 藥品與試劑

ACT001（批號20120704，質量分數＞99%）購自尚德藥緣科技有限公司；14C-氨基馬尿酸（批號1558673）、3H-硫酸雌酮（批號140331）、3H-地高辛（批號160624）、14C-溴化四乙胺（批號130311）、3H-牛磺膽酸（批號140403）購自美國ARC公司；UTIMA Gold閃爍液（批號77-15481）購自美國PerkinElmer公司；奎尼丁（批號10138583，質量分數≥98%）購自美國Sigma公司；丙磺舒（批號15327，質量分數＞99%）、利福平（批號11246，質量分數＞98%）、維拉帕米（批號18578，質量分數＞99%）、BCRP抑制劑Ko143（質量分數＞99%）購自美國MCE公司；異甘草素（質量分數＞98%）購自國家藥品和生物制品控制研究所；DMEM培養基（批號8117283）、胎牛血清（批號1912660C）、0.25%胰酶-EDTA（批號1919590）購自美國Gibco公司；100×青鏈霉素混合液（批號20180624）、PBS緩沖液（批號P1010）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號520C032）、DEPC水購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell?12孔聚碳酸酯膜轉運板（批號20917020）購自美國Corning公司；P-gp抗體、BCRP抗體購自ABclonal Technology公司；β-actin抗體購自英國Abcam公司；山羊抗兔IgG抗體購自Abkkine公司；TRNzol Reagent購自北京天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒、實時定量試劑盒購自Roche公司；MTS細胞增殖檢測試劑盒購自天津厚普生物技術開發有限公司。

1.2 儀器

CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；BS124S型分析天平（德國Sartorius公司）；CO2培養箱、臺式高速冷凍離心機、Varioskan Flash酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Tri-Carb 2910 TR型放射性液體閃爍儀（美國PerkinElmer公司）；FLE712AA型多孔濾器（日本Advantec公司）；Millcell ERS-2型跨上皮電阻儀（美國Millipore公司）；ZHWY型上海智誠恒溫振蕩器（北京華威興業科技有限公司）；LCMS-8060型三重四極桿液質聯用儀（日本島津公司）；Life ECO PCR基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）；Mastercycler ep Realplex2qRT-PCR儀（德國Eppendorf公司）。

1.3 細胞株

藥物轉運體過表達單克隆細胞株MDCKOAT1、S2-OAT3、HEK293-OATP1B1、HEK293-OATP1B3、S2-OCT1、S2-OCT2、MDCK-MDR1及空白載體轉染細胞（MDCK-Mock、S2-Mock、HEK293-Mock）均由日本富士生物醫藥研究所贈予；BCRP/膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）/mock基因表達 inside-out vesicles購自日本GenoMembrane公司；Caco-2細胞及LS-180細胞購自國家實驗細胞資源共享平臺。

2 方法

2.1 細胞培養

所有細胞系均于培養皿內，用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養基，于37 ℃（S2細胞在33 ℃）、5% CO2和相對濕度90%的培養箱內培養，當細胞融合度為80%～90%時，用胰酶消化成細胞懸液。本實驗所用的Caco-2細胞為35～38代，LS-180細胞為26～30代，MDCK-MDR1細胞為25～28代、MDCK-BCRP細胞為26～29代，轉運體細胞為26～35代。

2.2 MTS測試

將MDCK細胞（2.5×104/mL）、HEK293細胞（8×104/mL）、S2細胞（8×104/mL）、Caco-2細胞（5×104/mL）、LS-180細胞（5×104/mL）分別接種于96孔板中培養24 h后，加入新鮮培養基配制系列濃度為1～100 μmol/L的ACT001的含藥培養基孵育48 h。隨后加入MTS溶液孵育，每隔一定時間取出，采用多功能酶標儀測定每孔在492 nm處的吸光度（A）值。每個濃度設置6個復孔。半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）使用GraphPad Prism軟件計算。

2.3 ACT001對轉運體的抑制作用

2.3.1 攝入轉運體 將細胞懸液用培養基稀釋至1.5×105/mL接種至24孔板（OATP1B1、OATP1B3基因表達細胞接種于D-聚賴氨酸包被的24孔板）培養至各孔細胞長滿。將24孔板置于37 ℃水浴中移去培養液，添加37 ℃緩沖液孵育10 min后移去緩沖液，添加含放射性標記的探針底物和各濃度ACT001（0.3～100 μmol/L）的混合溶液，在設定時間移去探針底物溶液，加入1 mL冰浴緩沖液終止反應。各轉運體的放標底物及濃度、陽性抑制劑及濃度和給藥時間見表1，每個濃度設置3個復孔。每孔添加0.1 mmol/L NaOH裂解細胞，將細胞裂解液轉移至EP管中，加入閃爍液，用閃爍儀測定樣品中的放射性強度。

表1 各轉運體給藥實驗條件Table 1 Test conditions for each transporter administration

2.3.2 外排轉運體P-gp 取MDCK-MDR1細胞懸液調整密度至1×105/mL，接種于Transwell 12孔板中，在細胞層頂端（AP）每孔加0.5 mL細胞懸液，基底端（BL）每孔加1.5 mL新鮮培養基。培養6 d，得到完全分化的細胞單層。棄去Transwell小室兩端的培養基，在兩側均按比例加入37 ℃預熱的HBSS溶液，置于37 ℃細胞培養箱中平衡20 min；棄去HBSS，在BL加入1.5 mL預熱的添加含3H-地高辛和各濃度ACT001（0.3～100 μmol/L）的HBSS溶液，在AP加入預熱的0.5 mL空白HBSS溶液；置于37 ℃振蕩器孵育15 min；取100 μL細胞AP的轉運液加入閃爍液，充分混勻后測定轉運液中的3H-地高辛濃度。

2.3.3 外排轉運體BCRP、BSEP ACT001對2種轉運體的抑制作用通過囊泡實驗測定。分別配制2種轉運體所用緩沖液和反應體系后，將inside-out vesicle放置于37 ℃水浴孵育5 min，加入混合液反應5 min后加終止液終止反應。將反應液和終止液混合置于濾膜上濾掉液體并用冰緩沖液清洗后取下濾膜，轉移至EP管中，加入閃爍液，用閃爍儀測定樣品中的放射性強度。放射性標記底物、陽性抑制劑、給藥時間見表1。

計算抑制率，以抑制率代表抑制作用強度。使用Prism 5.0軟件計算ACT001抑制各轉運體轉運活性的IC50。各數值間的差異性分析采用t檢驗。

抑制率＝(U-U0)/(Uc-U0)Uc表示對照組的DPM（每分鐘衰變數）值，U0表示Mock細胞的DPM值，U表示各給藥組的DPM值

2.4 LC-MS/MS檢測

2.4.1 色譜條件 Acquity UPLC?BEH C8色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為甲醇-乙腈（1∶1），流動相B為5 mmol/L甲酸胺-10%甲醇水溶液，梯度洗脫：0～3 min，90% B；3～4 min，90%～10% B；4～5 min，10%～90% B；1.5～2.8 min切入質譜儀。體積流量為0.3 mL/min；進樣量2 μL；柱溫40 ℃；內標（IS）為吲達帕胺。

2.4.2 質譜條件 ESI離子源，正離子模式；霧化氣體積流量為3 L/min；加熱氣體積流量為10 L/min；接口溫度為300 ℃；去溶劑氣溫度為250 ℃；熱塊溫度為400 ℃；干燥氣體積流量為10 L/min；掃描方式為多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）。

2.4.3 樣品處理 配制梯度標曲及質控樣品，線性范圍為0.5～25 μmol/L（用50%甲醇溶液配制）。取50 μL 50% Hanks液，分別加入50 μL甲醇和50 μL內標溶液（含1 μg/mL吲達帕胺的甲醇溶液），再加入50 μL標液/樣品，渦旋1 min；取出50 μL溶液，分別加入450 μL 50%甲醇稀釋，渦旋混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；再取100 μL溶液于內插管中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，進樣2 μL，進行LC-MS/MS定量分析。

2.4.4 方法學驗證 ACT001的LC-MS/MS定量分析方法經過了完整的方法學驗證，在該分析方法下，細胞中的其余物質不會干擾待測物和內標的測定，ACT001的線性范圍為0.5～25.0 μmol/L，ACT001保留時間為2.13 min。配制低、中、高濃度（0.5、10、50 μmol/L）的ACT001溶液，分別測定化合物的穩定性、方法的準確度和精密度。結果顯示，ACT001穩定性的RSD＜15%，精密度的RSD為4.9%，準確度的RSD為5.7%。

2.5 底物研究

取Caco-2細胞懸液調整密度至2×105/mL接種于Transwell 12孔板中。連續培養21 d，得到完全分化的細胞單層。棄去Transwell舊培養基，加入37 ℃預熱的HBSS溶液平衡20 min；取出板子后，在細胞AP加入0.5 mL預熱的含有ACT001的HBSS溶液，BL加入1.5 mL預熱的HBSS，以此檢測細胞AP到BL的轉運；在細胞AP加入0.5 mL預熱的HBSS，BL加入1.5 mL預熱的含有ACT001的HBSS溶液檢測BL到AP的轉運。37 ℃恒溫振蕩器孵育15 min后吸取轉運液，測定其中ACT001濃度。在檢測外排轉運蛋白BCRP抑制劑Ko143（5 μmol/L）對ACT001在MDCK-BCRP/Caco-2細胞單層上轉運的影響和P-gp抑制劑維拉帕米（30 μmol/L）對ACT001在MDCK-MDR1/Caco-2細胞單層上轉運的影響時，用同時含有抑制劑和藥物的給藥液代替只含藥物的給藥液即可。ACT001的給藥濃度為3、30 μmol/L。每個濃度重復3次。用LCMS/MS測定ACT001在轉運液中的濃度。

以表觀滲透系數（apparent permeation coefficient，Papp）的大小反映藥物透過單層細胞的能力以及藥物吸收的速度。

Papp＝V×(dC/dt)×1/A×1/C0

V表示接收室的溶液體積（AP端為0.5 cm3、BL端為1.5 cm3），A表示膜的面積（1.13 cm2），C0表示藥物的起始濃度，dC/dt表示接收室在單位時間獲得的藥物濃度，即接收室的最終濃度除以轉運時間

以外排率（efflux ratio，RE）代表藥物外排能力的大小，通過RE可以預測藥物在腸吸收是否存在藥物轉運蛋白介導的外排或攝入。

RE＝Papp(B-A)/Papp(A-B)

A-B代表AP→BL，B-A代表BL→AP，當所測藥物的RE≥2時，表示藥物可能為腸道外排轉運蛋白的底物，當所測藥物的RE≤0.5時，表示該藥物可能為腸道攝入轉運蛋白的底物

2.6 誘導研究

LS-180細胞以1.5×105/mL接種于24孔板中，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h，每孔加入1 mL含誘導劑和待測藥的培養基。其中分為空白組：含0.1% DMSO的培養基；陽性藥組：分別為含10 μmol/L利福平、1 μmol/L異甘草素的培養基；給藥組：含3、10、20 μmol/L ACT001的培養基；每組設置3個復孔。每24小時更換1次相同的培養基，設置不同誘導時間組，細胞與誘導劑作用時間分別為48、72、96 h。誘導完成后用TRNzol總RNA提取試劑處理細胞，提取RNA并逆轉錄為cDNA，用qRT-PCR進行擴增檢測。

以逆轉錄的cDNA為模板，qRT-PCR反應體系為Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）12.5 μL、上游引物（10 μmol/L）0.75 μL、下游引物（10 μmol/L）0.75 μL、水9 μL、cDNA模板2 μL，總體積25 μL。反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個循環，60～95 ℃熔解曲線分析。引物序列見表2。采用2?ΔΔCt法，測定樣品中P-gp、BCRP目的基因和β-actin內參基因的Ct值，計算給藥組細胞基因與空白組細胞基因相比較的表達倍數。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

另取誘導完成后的樣品用RIPA試劑處理提取總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白后進行Western blotting檢測。使用Gel-Pro Analyzer 4軟件對結果進行灰度分析；使用GraphPad Prism 5軟件對結果進行繪制柱形圖。

3 結果

3.1 MTS檢測

MTS實驗考察化合物對細胞的毒性作用，LS-180細胞實驗結果顯示，ACT001對LS-180細胞的IC50大于40 μmol/L；以相同的方法處理實驗使用的其他細胞，結果表明ACT001對Caco-2、S2、MDCK和HEK293細胞的IC50均大于100 μmol/L，說明本研究所使用的濃度在細胞安全合理范圍內，對細胞沒有毒性。

3.2 ACT001對轉運體的抑制作用研究

轉運活性抑制實驗中ACT001的給藥濃度為0.3～100 μmol/L，結果見圖2，ACT001對OAT1介導的14C-氨基馬尿酸、OAT3介導的3H-硫酸雌酮、OCT1介導的14C-溴化四乙胺、OCT2介導的14C-溴化四乙胺、OATP1B1介導的3H-硫酸雌酮、P-gp介導的3H-地高辛、BSEP介導的3H-牛磺膽酸的轉運活性無影響或影響較弱，IC50均大于100 μmol/L；對BCRP介導的3H-硫酸雌酮轉運活性有明顯抑制作用，即對BCRP的轉運活性有顯著影響，IC50為48.6 μmol/L。

圖2 ACT001對臨床關鍵轉運體的抑制作用 ( , n = 3)Fig.2 Inhibitory effect of ACT001 on clinical key transporters ( , n = 3)

3.3 底物研究

預試實驗結果表明，30 μmol/L ACT001給藥15 min時Papp值最佳。如表3所示，ACT001在30 μmol/L濃度下，攝入方向的Papp值為2～4，有外排現象，添加BCRP抑制劑Ko143后外排被明顯抑制。

表3 ACT001在Caco-2、MDCK-BCRP和MDCK-MDR1細胞中雙向轉運的Papp值和RE值 ( , n = 3)Table 3 Papp and RE of ACT001 bi-directional transport in Caco-2, MDCK-BCRP and MDCK- MDR1 cell (, n = 3)

表3 ACT001在Caco-2、MDCK-BCRP和MDCK-MDR1細胞中雙向轉運的Papp值和RE值 ( , n = 3)Table 3 Papp and RE of ACT001 bi-directional transport in Caco-2, MDCK-BCRP and MDCK- MDR1 cell (, n = 3)

細胞 組別 濃度/(μmol·L?1) Papp/(×10?6 cm·s?1) RE AP→BL AP→BL Caco-2 ACT001 30 1.08±0.33 3.18±0.64 2.95 ACT001+Ko143 30 1.17±0.64 0.94±0.07 0.80 ACT001+維拉帕米 30 1.10±0.07 2.67±0.02 2.43 MDCK-BCRP ACT001 30 4.40±3.28 30.13±10.40 6.84 ACT001+Ko143 30 24.72±6.12 43.90±18.72 1.78 MDCK-MDR1 ACT001 30 30.42±7.09 22.57±3.01 0.74 ACT001+維拉帕米 30 39.40±6.73 40.14±5.38 1.02

以上數據說明ACT001在Caco-2細胞中跨膜能力中等，存在外排轉運體BCRP參與的主動轉運，在較高濃度時外排更強，且加入BCRP抑制劑后ACT001的跨膜能力達到良好。在MDCK-BCRP細胞中，ACT001在30 μmol/L濃度下給藥，攝入方向的Papp值隨著給藥濃度的增大而降低，在30 μmol/L濃度下，外排現象明顯，添加BCRP抑制劑Ko143后外排被明顯抑制；在MDCK-MDR1細胞中，ACT001沒有表現出外排現象，添加P-gp抑制劑也不產生影響。說明ACT001為外排轉運體BCRP的底物。

3.4 誘導研究

如圖3所示，ACT001孵育72 h可不同程度地上調LS-180細胞外排轉運體P-gp、BCRP的mRNA表達水平，誘導96 h及以上會造成LS-180細胞的脫落，因此本研究只討論誘導72 h時的結果。

圖3 ACT001對LS-180細胞P-gp和BCRP mRNA表達的影響 ( , n = 3)Fig.3 Effect of ACT001 on P-gp and BCRP mRNA expressions in LS-180 cells ( , n = 3)

利福平作為常用的P-gp誘導劑，對P-gp的誘導作用顯著，誘導倍數達到26.2倍。10 μmol/L的ACT001孵育72 h可分別上調P-gp和BCRP的mRNA表達水平8.98、8.21倍，而3、20 μmol/L的ACT001孵育72 h可使P-gpmRNA表達水平上調3.28、1.66倍；相同條件下，使BCRPmRNA表達水平上調2.43、1.54倍。蛋白誘導結果見圖4，3、10、20 μmol/L的ACT001使P-gp蛋白表達水平分別上調3.06、3.76、1.44倍；相同條件下，使BCRP蛋白表達水平分別上調3.95、2.92、0.26倍。

圖4 ACT001對LS-180細胞P-gp和BCRP蛋白表達的影響 ( , n = 3)Fig.4 Effect of ACT001 on P-gp and BCRP protein expressions in LS-180 cells ( , n = 3)

4 討論

Caco-2細胞系來源于人結腸腺癌細胞，同源性好，在體外培養條件可自發進行腸道上皮樣分化形成微絨毛結構，生成細胞間緊密連接蛋白，且表達各種蛋白載體和酶，與小腸上皮細胞結構類似[16]。應用Caco-2細胞模型得到的數據與體內數據基本一致，條件可控，重復性好，且相比于動物模型，實驗成本低，國內外廣泛應用于藥物跨膜轉運能力和跨膜轉膜機制進行評價。與Caco-2細胞模型相比，LS-180細胞模型中參與外排轉運體表達調控過程的人孕烷受體（pregnane X receptor，PXR）和類固醇外源異物受體（steroid and xenobiotic receptor，SXR）表達水平較高[17-18]，因此誘導效果更為顯著，是轉運體體外細胞誘導試驗中的常見模型[19]。

腦膠質瘤具有很高的發病率和死亡率。ACT001是針對膠質瘤的I類新藥，具有明顯的臨床價值。先前文獻報道大鼠組織分布研究中在腦組織檢測到ACT001的存在，但本研究首次證明ACT001是BCRP的底物，BCRP在血腦屏障和腫瘤細胞中高表達[20-21]，ACT001雖跨膜能力良好，但因是BCRP的底物，可被外排導致其生物利用度受到影響。

前期研究基于ACT001的結構特征和PBPK/PD模擬結果顯示ACT001具有較高的血腦屏障滲透性，并未報道ACT001與藥物轉運體的具體作用關系。本研究首次從轉運體角度證明ACT001是BCRP的底物以及BCRP和P-gp的誘導劑。BCRP和P-gp在血腦屏障中高表達，因此，ACT001在實際應用中可能會因BCRP和P-gp的外排作用而使藥效受到一定影響。

ACT001的臨床前藥動學研究表明，大鼠（雄鼠）單次poACT001（20、100、500 mg/kg）體內血藥濃度分別可以達到約5、25、50 μmol/L[22]，因此本研究選擇3、10、20 μmol/L 3個濃度作為底物研究和誘導作用研究的給藥濃度，不會對細胞生長增殖造成影響；該研究結果對ACT001的實際臨床應用具有參考價值。

本研究表明，ACT001對P-gp和BCRP蛋白具有誘導表達的作用，P-gp、BCRP二者與代謝酶具有較高的底物重疊率，對P-gp和BCRP表達水平產生誘導時，由于競爭和誘導作用，極有可能會出現轉運體和代謝酶[23-24]介導的藥物-藥物相互作用[25-27]，這為正確理解ACT001可能存在的藥物相互作用提供了新的思路。另外，腫瘤細胞中P-gp和BCRP過表達會使腫瘤細胞產生耐藥性，導致治療效果不理想。提示ACT001在臨床上應與BCRP抑制劑聯合使用，這可能會增加ACT001在腦組織和腫瘤細胞內的暴露量，從而提高療效。本研究為ACT001與藥物轉運蛋白之間的關聯提供了新的見解，并為其臨床試驗和應用提供了合理、有效的參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突