基于InsR/PI3K/Akt通路研究巖黃連總堿糾正高脂喂養小鼠糖代謝紊亂的作用機制

劉宏民，吳潔潔，陳 歡，韓雪婷，邱志霞，黃 芳

中國藥科大學中藥學院 中藥藥理與中醫藥學系，江蘇 南京 210009

2型糖尿病是一種慢性代謝紊亂綜合征，是全球第4大死亡病因，其特征是脂質和糖代謝的穩態失衡，從而導致胰島素抵抗和高血糖的發生[1]。胰島素抵抗指肝臟、肌肉和脂肪組織等周圍靶組織細胞對胰島素的敏感性降低、胰島素促進的葡萄糖攝取和利用效率下降，從而產生高血糖癥、高胰島素血癥以及血脂紊亂等一系列臨床表現[2]。已有大量研究表明，胰島素抵抗是2型糖尿病發病機制之一，貫穿于整個糖尿病的發生發展進程中[3]。

巖黃連為罌粟科多年生草本植物石生黃堇Corydalis saxicolaBunting的干燥全草，主要產于廣西、云南、貴州等地區，是一味珍貴的民間中藥[4]。其性涼、味苦，歸胃、大腸經。《貴州民間藥物》記載其有清熱解毒、止痛止血的功效[5]。巖黃連總堿是巖黃連的主要活性部位。現代研究表明巖黃連總堿具有保肝、抗癌、抗氧化、抗炎等藥理作用[6]，臨床上用于治療急慢性肝炎、病毒性肝炎、肝癌、高膽紅血素癥等肝病[7]。目前不斷有實驗證明，巖黃連總堿對脂質代謝相關脂肪性肝病具有明顯的改善作用[8]，但通過調控糖代謝糾正或者逆轉上述代謝性疾病發生發展進程[9]卻鮮有報道，因此本研究主要從糖代謝途徑出發，以高脂飲食誘導的胰島素抵抗小鼠為模型[10]，探究巖黃連總堿對胰島素抵抗的改善作用及作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠60只，6～8周齡，體質量18～22 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證號SCXK（蘇）2016-0010。動物飼養于中國藥科大學藥學動物實驗中心，溫度18～22 ℃，濕度55%～65%，自由活動、飲水、飲食，適應性喂養1周后，進行高脂飲食造模。所有動物實驗均嚴格按照實驗動物管理法規的規定和總則建議進行（倫理審批號2020-12-001）。

1.2 藥品與試劑

巖黃連總堿（含脫氫卡維丁19.79%、鹽酸巴馬汀5.33%、鹽酸小檗堿0.95%，批號160801），由南京中山制藥有限公司提供；鹽酸二甲雙胍片（批號2008108）購自北京京豐制藥集團有限公司；60%高脂肥胖模型飼料（批號TP23400）、低脂對照飼料（批號TP23402）購自南通特洛菲飼料科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）測試盒（批號F002-1-1）、三酰甘油（triglycerides，TG）測定試劑盒（批號A110-1-1）、糖化血清蛋白（glycosylated serum protein，GSP）試劑盒（批號A037-2-1）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDLC）測定試劑盒（批號A113-1-1）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒（批號A112-1-1）均購自南京建成生物科技有限公司；糖原含量檢測試劑盒（批號BC0345）購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠胰島素酶聯免疫吸附測定試劑盒（批號E-EL-M1382c）、小鼠瘦素酶聯免疫吸附測定試劑盒（批號E-EL-M3008）、小鼠脂聯素（adiponectin/ADPN，ADP/Acrp30）酶聯免疫吸附測定試劑盒（批號E-EL-M0002c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；β-actin抗體（批號AF701）、磷酸烯醇式丙酮酸激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）抗體（批號DF6770）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）抗體（批號AF6241）、p-PI3K抗體（批號AF3241）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號AF6261）、p-Akt抗體（批號AF0016）、叉頭框蛋白O1（Forkhead box protein O1，FoxO1）抗體（批號AF6416）、p-FoxO1抗體（批號AF3417）、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）抗體（批號AF5016）、p-GSK-3β抗體（批號AF2016）均購自Affinity公司；山羊抗兔二抗（批號ZJ2020-R）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0010S）均購自上海碧云天生物技術有限公司；ECL化學發光超敏顯色試劑盒（批號36208ES76）購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3 儀器

5415R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；PB303-N型電子天平（德國Mettler Toledo公司）；MULTSKAN Sky全波長酶標儀、可調式移液器（美國Thermo Fisher Scientific公司）；血糖儀及血糖試紙（江蘇魚躍醫療設備有限公司）；電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；顯影儀（上海天能科技有限公司）；Direct-Q3實驗室純水/超純水一體化系統（美國Millipore公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只C57BL/6小鼠，按體質量隨機分成6組，每組10只，依次為對照組、模型組及巖黃連總堿低、中、高劑量（25、50、100 mg/kg）組和鹽酸二甲雙胍（200 mg/kg）組[11]。對照組給予低脂飼料，其余各組給予高脂飼料，6周后各給藥組ig相應藥物（10 mL/kg）[12]，連續給藥4周。

2.2 體質量的測定

給藥期間每隔1 d測定并記錄小鼠體質量。

2.3 空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平與口服葡萄糖耐量（oral glucose tolerance test，OGTT）的檢測

末次給藥后，小鼠禁食12 h，自由飲水，次日清晨測定FBG；各組小鼠ig葡萄糖溶液（2 g/kg）[13]，測定ig后15、30、60、90、120 min小鼠血糖水平，計算曲線下面積（area under curve，AUC）。

2.4 血清生化指標的檢測

小鼠眼眶取血，室溫靜置2 h，3000 r/min離心15 min，取上清液，于?80 ℃保存備用，按照試劑盒說明書分別檢測血清中TC、TG、GSP、LDL-C、HDL-C、胰島素、瘦素、ADP/Acrp30的含量。

2.5 肝糖原含量的測定

取適量肝臟，按照試劑盒說明書檢測肝臟組織中糖原含量。

2.6 Western blotting法測定肝臟中相關蛋白表達

稱取適量肝組織，剪碎并按照1∶10的比例加入RIPA強裂解液，裂解液中提前加入1/100的蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑，電動勻漿后靜置20 min，待充分裂解后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液。BCA法測定蛋白濃度，隨后加入1/4體積的5×loading buffer，沸水浴15 min使蛋白變性，進行10% SDS-PAGE垂直電泳，轉至PVDF膜，加入5%牛血清白蛋白，室溫封閉2 h，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜；次日TBST漂洗，加入二抗孵育，ECL顯影，采用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值[14]。

2.7 統計學處理

所有數據用GraphPad Prism 7和IBM SPSS statistics 22軟件進行統計分析，計量資料用表示，組間差異用單因素方差分析One-way ANOVA及LSD-t檢驗比較。

3 結果

3.1 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠體質量的影響

如表1所示，經過10周的喂養，各組小鼠體質量均有增加。與對照組相比，模型組小鼠體質量明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，巖黃連總堿組和二甲雙胍組小鼠體質量無顯著變化，表明巖黃連總堿對高脂喂養小鼠體質量沒有影響，只是改善了小鼠糖代謝紊亂。

表1 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠體質量的影響 ( , n = 7)Table 1 Effect of C.saxicola total alkaloids on body weight in insulin resistant mice ( , n = 7)

表1 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠體質量的影響 ( , n = 7)Table 1 Effect of C.saxicola total alkaloids on body weight in insulin resistant mice ( , n = 7)

與對照組比較：##P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group

組別 劑量/(mg·kg?1) 體質量/g給藥第0周 給藥第1周 給藥第2周 給藥第3周 給藥第4周對照 — 22.86±0.38 23.00±0.82 24.43±0.79 23.43±0.54 24.14±0.69模型 — 25.71±1.38## 26.43±1.40## 26.57±1.27## 27.71±1.25## 28.14±1.57##巖黃連總堿 25 26.57±1.99 26.86±2.12 26.86±2.34 27.29±2.43 27.71±2.14 50 25.57±0.98 25.86±1.07 27.00±1.16 27.29±1.70 27.43±2.15 100 26.57±0.54 27.14±0.90 27.71±0.95 28.43±1.40 27.71±1.11二甲雙胍 200 26.14±0.90 26.14±1.35 26.86±0.69 26.71±0.95 26.57±1.13

3.2 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠FBG、胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment，HOMAIR）與OGTT的影響

如表2所示，與對照組相比，模型組小鼠FBG、血清胰島素水平及HOMA-IR明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，巖黃連總堿中、高劑量組小鼠FBG、胰島素水平及HOMA-IR均顯著降低（P＜0.01），巖黃連總堿低劑量組小鼠血清胰島素水平及HOMA-IR均顯著降低（P＜0.01）。

表2 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠FBG、血清胰島素和HOMA-IR的影響 ( , n = 7)Table 2 Effect of C.saxicola total alkaloids on FBG, blood insulin and HOMA-IR in insulin resistant mice ( , n = 7)

表2 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠FBG、血清胰島素和HOMA-IR的影響 ( , n = 7)Table 2 Effect of C.saxicola total alkaloids on FBG, blood insulin and HOMA-IR in insulin resistant mice ( , n = 7)

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下表同#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group, same as below tables

組別 劑量/(mg·kg?1) FBG/(mmol·L?1) 胰島素/(ng·mL?1) HOMA-IR對照 — 4.06±0.37 28.05±1.77 4.99±0.42模型 — 6.94±0.72## 36.17±4.14## 10.84±0.80##巖黃連總堿 25 6.39±0.56 31.53±2.83** 8.76±1.01**50 5.76±0.58** 29.21±2.67** 7.38±0.91**100 5.14±0.78** 26.89±3.21** 6.04±1.16**二甲雙胍 200 3.59±0.76** 26.49±2.09** 3.92±0.68**

如表3所示，各組小鼠ig葡萄糖15 min后血糖值達到峰值，15～30 min血糖值緩慢降低，30～90 min血糖值快速降低；當120 min時二甲雙胍給藥組降到6.4 mmol/L，與模型組比較差異顯著（P＜0.05）；巖黃連總堿高劑量組降到7.36 mmol/L，與模型組有極顯著性差異（P＜0.01）；巖黃連總堿中劑量組血糖值為7.51 mmol/L，與模型組比較差異顯著（P＜0.05）。與對照組相比，模型組小鼠血糖AUC顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，各給藥組小鼠血糖AUC的差異均具有統計學意義（P＜0.01）。表明巖黃連總堿可以降低血糖、血胰島素水平，增強機體對胰島素的敏感性，從而恢復機體對血糖的調節能力。

表3 巖黃連總堿對高脂喂養小鼠OGTT的影響 ( , n = 7)Table 3 Effect of C.saxicola total alkaloids on OGTT in high-fat fed mice ( , n = 7)

表3 巖黃連總堿對高脂喂養小鼠OGTT的影響 ( , n = 7)Table 3 Effect of C.saxicola total alkaloids on OGTT in high-fat fed mice ( , n = 7)

組別 劑量/(mg·kg?1)血糖/(mmol·L) 血糖AUC/mm2 0 min 15 min 30 min 60 min 90 min 120 min對照 — 4.06±0.37 16.28±1.22 12.93±0.94 8.56±0.98 7.06±0.51 6.01±0.25 49.86±1.36模型 — 6.94±0.72## 18.84±1.55## 16.05±1.76## 12.79±0.80## 9.84±0.40## 8.30±0.39# 65.14±1.82##巖黃連總堿 25 6.39±0.56 13.01±1.48** 12.30±2.09** 11.19±1.98 9.63±0.83 7.66±0.66 53.15±2.40**50 5.76±0.58** 13.00±1.13** 11.48±1.34** 10.46±1.03** 9.07±0.47 7.51±0.32* 50.64±1.51**100 5.14±0.78** 12.99±1.36** 10.66±1.10** 9.73±0.41** 8.51±0.40** 7.36±0.27** 50.69±1.60**二甲雙胍 200 3.59±0.76** 14.84±0.86** 11.36±1.92** 10.80±0.80** 7.67±1.46* 6.40±1.28* 49.66±2.03**

3.3 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、GSP、瘦素、ADP/Acrp30水平的影響

如表4所示，與對照組相比，模型組小鼠TG、TC、LDL-C、GSP、瘦素水平顯著上升（P＜0.01），HDL-C水平變化不明顯，僅有下降趨勢，ADP/Acrp30水平顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，各給藥組TG、TC、LDL-C、GSP、瘦素水平均降低（P＜0.01），而且巖黃連總堿在一定程度上升高了HDL-C的水平（P＜0.05），使得ADP/Acrp30水平顯著升高（P＜0.05）。表明巖黃連總堿可以通過改善脂質代謝紊亂，高劑量組從而恢復機體糖代謝穩態。

表4 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠血清學指標的影響 (, n = 7)Table 4 Effect of C.saxicola total alkaloids on serological indexes of insulin resistant mice ( , n = 7)

表4 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠血清學指標的影響 (, n = 7)Table 4 Effect of C.saxicola total alkaloids on serological indexes of insulin resistant mice ( , n = 7)

組別 劑量/(mg·kg?1) TG/(mmol·L?1) TC/(mmol·L?1) LDL-C/(mmol·L?1) HDL-C/(mmol·L?1)對照 — 1.26±0.13 2.70±0.20 0.36±0.07 9.53±0.85模型 — 2.23±0.26## 4.52±0.34## 0.91±0.17## 9.00±0.27巖黃連總堿 25 1.49±0.12** 3.78±0.23** 0.64±0.17** 9.37±0.41 50 1.48±0.13** 3.67±0.18** 0.53±0.10** 9.52±0.38 100 1.47±0.17** 3.57±0.31** 0.45±0.12** 9.67±0.51*二甲雙胍 200 1.45±0.14** 3.53±0.62** 0.50±0.15** 9.88±0.85**組別 劑量/(mg·kg?1) GSP/(mmol·L?1) 瘦素/(ng·mL?1) ADP/Acrp30/(ng·mL?1)對照 — 6.33±0.36 1.37±0.14 162.40±8.52模型 — 7.00±0.37## 7.08±0.76## 147.48±5.37##巖黃連總堿 25 6.16±0.48** 2.43±0.80** 152.88±9.93 50 5.80±0.37** 2.39±0.58** 155.78±8.51 100 5.44±0.34** 2.35±0.74** 158.68±10.64*二甲雙胍 200 5.26±0.32** 1.75±0.33** 153.93±10.34

3.4 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠糖異生的影響

如圖1所示，與對照組相比，模型組小鼠肝臟中PEPCK蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）[15]，p-FoxO1/FoxO1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；經給藥治療后，巖黃連總堿組和二甲雙胍組小鼠肝臟中PEPCK蛋白表達水平與模型組相比顯著降低（P＜0.01），p-FoxO1/FoxO1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05、0.01）。表明巖黃連總堿可以增強機體對于葡萄糖的利用率，降低代償性糖異生，從而糾正糖代謝紊亂。

圖1 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠糖異生的影響 ( , n = 3)Fig.1 Effect of C.saxicola total alkaloids on gluconeogenesis in insulin resistant mice ( , n = 3)

3.5 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠肝糖原的影響

如表5所示，與對照組相比，模型組小鼠肝糖原含量顯著降低（P＜0.05）。如圖2所示，模型組小鼠肝臟中p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；經過給藥治療后，與模型組相比，巖黃連總堿中、高劑量組和二甲雙胍組小鼠肝糖原含量顯著升高（P＜0.01），肝臟中p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05、0.01）。表明巖黃連總堿可以促進肝糖原的合成。

圖2 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠糖原合成的影響( , n = 3)Fig.2 Effect of C.saxicola total alkaloids on glycogen synthesis in insulin resistant mice ( , n = 3)

表5 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠肝糖原含量的影響( , n = 7)Table 5 Effect of C.saxicola total alkaloids on liver glycogen content of insulin resistant mice ( , n = 7)

表5 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠肝糖原含量的影響( , n = 7)Table 5 Effect of C.saxicola total alkaloids on liver glycogen content of insulin resistant mice ( , n = 7)

組別 劑量/(mg·kg?1) 肝糖原/(mg·g?1)對照 — 3.21±0.91模型 — 2.39±0.49#巖黃連總堿 25 2.81±0.68 50 3.34±0.35**100 3.87±0.63**二甲雙胍 200 3.62±0.49**

3.6 巖黃連總堿對InsR/PI3K/Akt通路的影響

如圖3所示，與對照組相比，模型組小鼠肝臟中InsR、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05、0.01）；經過給藥治療后，與模型組相比，巖黃連總堿高劑量組和二甲雙胍組InsR蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），巖黃連總堿中、高劑量組和二甲雙胍組p-PI3K/PI3K蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），巖黃連總堿高劑量組p-Akt/Akt蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。表明巖黃連總堿可以激活InsR/PI3K/Akt通路，增強胰島素的敏感性，從而糾正糖代謝異常。

圖3 巖黃連總堿對胰島素抵抗小鼠肝臟InsR、PI3K和Akt蛋白表達的影響 ( , n = 3)Fig.3 Effect of C.saxicola total alkaloids on protein expressions of InsR, PI3K and Akt in liver of insulin resistant mice (,n = 3)

4 討論

本研究結果表明，在小鼠胰島素抵抗模型中，小鼠表現出血糖、血清胰島素、GSP升高，糖耐量異常等糖代謝紊亂相關表型[16]，而巖黃連總堿可顯著降低胰島素小鼠FBG、血清胰島素和GSP水平，逆轉糖耐量的異常狀態，說明巖黃連總堿可以增強機體對胰島素的敏感性，從而恢復機體對血糖的調節能力；小鼠血清中脂質代謝相關指標表明，高脂飲食會導致小鼠脂質代謝出現異常，且與糖脂代謝紊亂具有一定的相關性，推測巖黃連總堿可以通過糾正小鼠的脂代謝紊亂，進而恢復小鼠的糖代謝穩態。瘦素是由脂肪細胞分泌的一種激素，可以作用于下丘腦的瘦素受體，促進下丘腦分泌多種激素，從而調節機體對食物的攝取進而控制機體體質量平衡[17]。然而數據顯示巖黃連總堿連續給藥后瘦素水平的改變并沒有引起體質量的明顯變化，可能巖黃連總堿雖然改善了脂肪組織的瘦素抵抗，使得血清瘦素水平發生變化，但并不能逆轉下丘腦的瘦素受體損傷，因此攝食量沒有顯著減少，進而導致體質量沒有顯著下降。ADP/Acrp30是另一種脂肪來源的激素，研究表明ADP/Acrp30可以逆轉胰島素抵抗[18]。巖黃連總堿可以上調血清ADP/Acrp30水平從而改善胰島素抵抗。有研究表明，GSK-3β的過量表達會引起其下游底物糖原合成酶（glycogen synthase，GS）活性降低，糖原合成異常，導致胰島素抵抗[19]，活化的Akt可以促進GSK-3β磷酸化從而使之失活，改善糖原代謝紊亂，而巖黃連總堿可以有效促進GSK-3β磷酸化，增強GS活性，增加機體肝糖原含量，從而改善糖代謝紊亂。在糖異生方面，由于胰島素抵抗的發生使得機體不能有效攝取與利用葡萄糖，機體便會代償增強糖異生水平，從而為自身提供葡萄糖。FoxO1是受胰島素信號負性調節的轉錄因子，通過激活胰島素信號轉到途徑引起下游的信號分子FoxO1發生磷酸化降解，從而降低FoxO1的轉錄活性，減少糖異生關鍵酶（如PEPCK）的表達，從而抑制糖異生[20]。巖黃連總堿可以上調p-FoxO1/FoxO1水平，下調PEPCK的表達，抑制糖異生，最終改善糖代謝。

胰島素信號轉導通路中有3種信號通路，包括PI3K通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路和C-Cbl相關蛋白通路。其中PI3K信號通路是最為經典的通路[21]。PI3K信號通路的正常轉導與糖脂代謝直接相關，任何PI3K信號通路轉導異常都可能導致胰島素抵抗的發生[22]。在生理條件下，胰島素可與其在細胞表面的受體（InsR）結合，IRS被磷酸化，隨后PI3K活化。活化的PI3K可將磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2）催化為PIP3，從而激活序列下游信號因子Akt。磷酸化的Akt將葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）轉運到質膜，后者負責將葡萄糖攝取到細胞中，從而降低血漿中葡萄糖水平。因此，InsR/PI3K/Akt信號通路在胰島素信號轉導中發揮重要的聯動調節作用，該途徑中的任何環節發生異常都會降低細胞對胰島素的敏感性，導致葡萄糖攝取和利用異常，葡萄糖耐量受損，最終引起血糖水平升高[23]。巖黃連總堿可以逆轉胰島素抵抗引起的InsR/PI3K/Akt信號通路下調，進而改善糖代謝過程與胰島素抵抗（圖4）[24]。

圖4 巖黃連總堿改善胰島素抵抗機制圖Fig.4 Mechanism of C.saxicola total alkaloids improving insulin resistance

綜上所述，巖黃連總堿能夠通過激活InsR/PI3K/Akt介導的胰島素信號通路，提高胰島素信號的傳導，降低血糖，減少糖異生，促進糖原合成，從而改善糖代謝。巖黃連總堿作為傳統的肝病治療藥物已經得到了臨床的認可，但在鎮痛、抗菌、改善代謝性疾病等領域仍具有極大的潛力。本研究為巖黃連總堿在糾正糖代謝紊亂方面提供了實驗方面的支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突