女貞子對去卵巢小鼠脂肪生成的抑制作用及Wnt/β-catenin信號通路的影響

劉亞鴿，戴 璇，劉田園，王 釤，張悅怡，盧美希，陳貝貝，朱如愿，王麗麗，張東偉

北京中醫藥大學中醫學院 糖尿病研究中心，北京 100029

肥胖是指人體內脂肪的過量累積，與其他組織失去正常比例的一種狀態，表現為脂肪細胞增多和（或）細胞體積增大。肥胖的發生與遺傳、生活習慣及內分泌激素失調等多種因素密切相關。長期的肥胖會誘發糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、骨關節病及心腦血管病等一系列疾病[1]。流行病學研究顯示，肥胖的發病率逐年增高，已經給個人和社會造成嚴重的負擔，并逐漸成為世界上主要的公共衛生問題之一[2]。近年來，絕經后女性因體內雌激素水平下降誘發骨代謝、肥胖等多種代謝綜合征逐漸引起研究者的興趣[3]。研究發現，絕經后女性常伴有體脂分布的改變，主要表現為內臟脂肪的積累增多[4]。雖然脂肪組織在生物體內能量代謝方面發揮著重要的調控作用[5]，但是與肥胖相關的內臟脂肪的過度積累會進一步增加患代謝綜合征的風險[6]。因此，探索內臟脂肪組織的代謝及發展新的治療方案對于防治絕經后肥胖有著重要的意義。

體內脂肪的生成主要受過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）和 CCAAT/增強劑結合蛋白 α（CCAAT/enhancer binding proteins α，C/EBPα）等多種成脂轉錄因子的調控[7]。研究發現，C/EBPα和PPARγ能夠相互調節，激活下游靶基因如脂肪細胞脂結合蛋白2、脂蛋白脂肪酶和膽固醇調節元件結合蛋白-1c（sterolregulatoryelement-bindingprotein-1c，SREBP-1c）等，從而調控脂肪細胞的生成[8]。研究也發現，無翅型MMTV整合位點家族（wingless type MMTV integration site family，Wnt）信號是脂肪組織發育的重要調節因子，與人類肥胖、體脂分布和代謝功能障礙有關[9]。Wnt信號可以調控骨髓間充質干細胞向脂肪細胞和成骨細胞雙向分化的能力，當Wnt信號被阻斷時骨髓基質細胞主要向脂肪細胞分化[10]。研究表明，Wnt/β-連環蛋白（Wnt/βcatenin）通路可以負調控成脂轉錄因子C/EBPα和PPARγ[11]，抑制脂肪生成[12]。

女貞子是一種藥食同用的中藥，首載于《神農本草經》：“補中，安五臟，養精神，除百病，久服，肥健輕身不老。”研究表明，女貞子具有抗骨質疏松[13-14]和抗肥胖[15]等作用。本課題組前期研究發現，女貞子可能通過調控Wnt/β-catenin通路調節骨代謝從而發揮抗骨質疏松的作用[16]。然而，女貞子能否通過調控該信號通路抑制脂肪生成，進而改善絕經后肥胖小鼠的脂代謝，目前未見相關報道。因此，本研究以去卵巢誘發的肥胖小鼠為模型，探討女貞子對去卵巢小鼠脂肪生成的影響及其作用機制，為防治絕經后肥胖等代謝性疾病提供新的策略。

1 材料

1.1 動物

SPF級雌性C57BL/6J小鼠24只，7周齡，體質量（20±2）g，購自北京斯貝福實驗動物科技有限公司，動物許可證號SCXK（京）2020-0004。動物于北京中醫藥大學科研實驗中心清潔級動物實驗室內飼養[合格證號SCXK（京）2020-0002]，12 h/12 h光暗周期，相對濕度（55±1）%，室溫（22±1）℃，以正常飼料喂養，實驗期間小鼠自由飲水攝食，籠具、墊料、飲用水等定期更換清潔。實驗方案經北京中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（批準號BUCM-4-2020091413-3066）。

1.2 藥材

女貞子購自北京同仁堂藥店總店，經北京中醫藥大學中藥博物館馬澤新教授鑒定為木犀科植物女貞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果實。

1.3 藥品與試劑

戊酸雌二醇（批號J20130009）購自德國拜耳公式；總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測試劑盒（批號20211028）、三酰甘油（triglyceride，TG）檢測試劑盒（批號20211028）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）檢測試劑盒（批號20211027）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測試劑盒（批號20211027）購自南京建成生物工程研究所；ECL超敏發光液（批號20210916）購自新賽美生物科技有限公司；Wnt 10b抗體（批號10011210）、PPARγ抗體（批號00091738）、C/EBPα抗體（批號00045016）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號10015666）、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號20000311）、HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號20000261）購自 Proteintech公司；β-catenin抗體（批號L02120962）、p-β-catenin抗體（批號l10233554）購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.4 儀器

EchoMRI-100H型身體成分分析儀（美國EchoMRI公司）；FLUO star Omega多功能酶標儀（德國BMG Labtech公司）；電泳和轉膜裝置（美國Bio-Rad公司）；Azure c500型凝膠成像儀（美國Azure Biosystems公司）；EG1150H型包埋機、EG1150C型冰凍機、RM2255型輪轉式切片機（德國Leica公司）；BX53型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 女貞子水提液的制備

按照郭魚波等[17]的方法制備女貞子水提液：將原生藥材女貞子打成粗粉后，準確稱取100 g，加入1 L蒸餾水，置于磁力攪拌器上低溫攪拌48 h后，低溫4000 r/min離心20 min后取上清，然后將上清于旋轉蒸發儀中低溫旋蒸，濃縮至含生藥0.35 g/mL的女貞子水提液，經HPLC-DAD-ESI-MS分析，女貞子水提液中主要含有紅景天苷、女貞苷、麥角甾苷、特女貞苷和橄欖苦苷酸等成分[18]。

2.2 去卵巢小鼠模型建立、分組、給藥及樣品處理

按照郭魚波等[17]的方法進行造模：將麻醉后的小鼠，切除雙側卵巢，其中對照組小鼠在卵巢附近切除同樣大小的脂肪組織。將造模成功的小鼠，隨機分為模型組、戊酸雌二醇（0.1 mg/kg）組和女貞子（3.5 g/kg，此給藥劑量在本課題組前期研究中已被證明對預防骨質疏松癥有效[16,18-19]）組，每組6只。各給藥組ig相應藥物，對照組和模型組ig等體積的蒸餾水，1次/d，連續12周。實驗期間，每周稱定各組小鼠的體質量。給藥結束后，各組小鼠ip 1%戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，4 ℃、3500 r/min離心10 min后，血清分裝于?80 ℃冰箱保存待用。同時取各組小鼠的皮下脂肪組織、內臟脂肪組織和肩胛處的棕色脂肪組織，其中一部分固定于4%多聚甲醛溶液中用于病理檢測，其余于?80 ℃冰箱中保存進行相應的實驗。

2.3 體脂成分測定

給藥結束后，采用身體成分分析儀測定并記錄各組小鼠體內脂肪含量，并計算各組小鼠脂肪與體質量的相對比率。

2.4 內臟脂肪組織的蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色

將固定在4%多聚甲醛溶液中的內臟脂肪組織按照常規HE染色法進行脫水包埋切片染色，中性樹膠封片后置于倒置顯微鏡下觀察脂肪組織病理變化并拍照。根據Shen等[20]的方法計算脂肪細胞大小，平均脂肪細胞大小表示為組織樣本中每個細胞的平均橫截面積（μm2/細胞）。

2.5 血清生化指標測定

按照試劑盒說明書分別測定血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量。

2.6 Western blotting檢測內臟脂肪組織蛋白表達

將內臟脂肪組織用RIPA裂解液裂解，采用低溫機械勻漿的方法提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將變性蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉后分別加入Wnt 10b抗體（1∶6000）、β-catenin抗體（1∶1000）、p-β-catenin抗體（1∶1000）、PPARγ抗體（1∶1000）、C/EBPα抗體（1∶1000）和GAPDH抗體（1∶20 000），4 ℃孵育過夜。次日，加入相應二抗（1∶4000），室溫孵育1 h，用ECL超敏發光液顯色，Azure凝膠成像儀拍照。以相應的GAPDH作為內參，利用Image J圖像分析軟件對各目標條帶的灰度值進行半定量分析。

2.7 統計學分析

利用GraphPad prism 8.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以表示。滿足正態分布且方差齊時采用單因素方差分析，方差不齊時使用近似F檢驗。不滿足正態分布時，則使用非參數檢驗。

3 結果

3.1 女貞子水提液對去卵巢小鼠體質量和體脂分布的影響

如圖1-A～C所示，與對照組相比，模型組小鼠的體質量和體脂相對比率顯著增加（P＜0.05），瘦體質量相對比率顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，各給藥組小鼠的體質量和體脂相對比率顯著下降（P＜0.05），瘦體質量相對比率顯著升高（P＜0.05）。

在體脂分布（圖1-D～F）方面，模型組小鼠內臟脂肪組織和皮下脂肪組織相對比率顯著高于對照組（P＜0.05），而戊酸雌二醇和女貞子水提液能夠顯著降低內臟脂肪組織和皮下脂肪組織相對比率（P＜0.05），棕色脂肪組織相對比率在各組間無顯著性變化。上述結果提示，女貞子水提液能夠抑制去卵巢小鼠體質量和體脂相對比率的增加，改善脂肪分布。

圖1 女貞子水提液對去卵巢小鼠體質量 (A)、體脂相對比率 (B)、瘦體質量相對比率 (C)、內臟脂肪相對比率 (D)、皮下脂肪相對比率 (E) 和棕色脂肪相對比率 (F) 的影響 ( , n = 6)Fig.1 Effect of Ligustri Lucidi Fructus aqueous extract on body weight (A), body fat relative ratio (B), lean relative ratio (C),visceral adipose tissue relative ratio (D), subcutaneous adipose tissue relative ratio (E) and brown adipose tissue relative ratio(F) in ovariectomized mice ( , n = 6)

3.2 女貞子水提液對去卵巢小鼠內臟脂肪組織脂肪細胞大小的影響

如圖2所示，與對照組相比，模型組小鼠內臟脂肪組織脂肪細胞的大小顯著增加（P＜0.05）。而雌二醇和女貞子水提液干預后，小鼠內臟脂肪組織脂肪細胞的大小顯著降低（P＜0.05）。說明女貞子水提液能夠抑制去卵巢小鼠內臟脂肪組織脂肪細胞肥大。

圖2 女貞子水提液對去卵巢小鼠內臟脂肪組織脂肪細胞大小的影響 ( , n = 6)Fig.2 Effect of Ligustri Lucidi Fructus aqueous extract on adipocyte size of visceral adipose tissue in ovariectomized mice( , n = 6)

3.3 女貞子水提液對去卵巢小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的影響

如圖3所示，模型組小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平較對照組分別升高了52.5%、54.0%和70.9%（P＜0.05），雌二醇和女貞子水提液干預能顯著降低去卵巢小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平（P＜0.05），但女貞子水提液對去卵巢小鼠血清中HDL-C水平無顯著性影響。以上結果表明，女貞子水提液能夠調節去卵巢小鼠的TC和TG代謝，從而改善機體的脂質代謝。

圖3 女貞子水提液對去卵巢小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影響 ( , n = 6)Fig.3 Effect of Ligustri Lucidi Fructus aqueous extract on TC, TG, LDL-C and HDL-C levels in serum of ovariectomized mice(, n = 6)

3.4 女貞子水提液對去卵巢小鼠內臟脂肪組織中成脂轉錄因子表達的影響

本研究主要探究女貞子對去卵巢小鼠脂代謝的影響。此外，已有研究表明雌二醇能夠通過Wnt/β-catenin信號通路抑制成骨細胞向成脂細胞的分化[21]，因此，以下機制研究部分將重點探索女貞子對脂肪代謝相關因子的作用。C/EBPα和PPARγ是脂肪生成過程中的關鍵調控因子[22]。采用Western blotting法檢測各組小鼠內臟脂肪組織中C/EBPα和PPARγ的蛋白表達水平，如圖4所示，與對照組相比，模型組小鼠內臟脂肪組織中C/EBPα和PPARγ蛋白表達水平顯著上調（P＜0.05）；與模型組相比，女貞子組小鼠內臟脂肪組織中C/EBPα和PPARγ蛋白表達水平顯著下調（P＜0.05）。表明女貞子水提液能夠抑制去卵巢小鼠內臟脂肪組織中C/EBPα和PPARγ的表達，從而抑制脂肪過度生成。

圖4 女貞子水提液對去卵巢小鼠內臟脂肪組織中成脂轉錄因子C/EBPα (A) 和PPARγ (B) 蛋白表達的影響 ( , n = 6)Fig.4 Effect of Ligustri Lucidi Fructus aqueous extract on protein expressions of adipogenic transcription factors C/EBPα (A)and PPARγ (B) in visceral adipose tissue of ovariectomized mice ( , n = 6)

3.5 女貞子水提液對去卵巢小鼠內臟脂肪組織Wnt和β-catenin蛋白表達的影響

如圖5所示，與對照組相比，模型組小鼠內臟脂肪組織Wnt 10b蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），p-β-catenin/β-catenin蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，女貞子組小鼠內臟脂肪組織中Wnt 10b蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），p-β-catenin/β-catenin蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。上述結果表明，女貞子水提液能夠激活去卵巢小鼠內臟脂肪組織中Wnt/β-catenin信號通路。

圖5 女貞子水提液對去卵巢小鼠內臟脂肪組織中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的影響 ( , n = 6)Fig.5 Effect of Ligustri Lucidi Fructus aqueous extract on related proteins expressions of Wnt/β-catenin signaling pathway in visceral adipose tissue of ovariectomized mice ( , n = 6)

4 討論

本研究采用經典的雙側去卵巢方法建立絕經后肥胖小鼠模型，發現去卵巢小鼠體質量和體脂相對比率顯著增加，血清中TC、TG和LDL-C水平顯著升高，內臟脂肪組織出現脂肪細胞肥大病變，內臟脂肪組織中成脂轉錄因子C/EBPα和PPARγ蛋白表達水平顯著升高，Wnt 10b蛋白表達水平顯著降低，p-β-catenin/β-catenin蛋白表達水平顯著升高。而女貞子水提液能夠抑制去卵巢小鼠體質量和體脂相對比率的增加，調節血脂水平，降低內臟脂肪組織中脂肪生成相關蛋白的表達水平，從而改善去卵巢小鼠的脂代謝。

本研究發現去卵巢小鼠體質量、體脂相對比率以及血清中TC、TG和LDL-C水平較假手術組顯著升高。而女貞子水提液干預后能明顯抑制去卵巢小鼠體質量和體脂相對比率的增長，降低血清中TC、TG和LDL-C水平，與文獻報道一致[17]。研究表明，脂肪細胞肥大導致的白色脂肪組織過度擴張是導致肥胖的重要原因[23]。本研究通過HE染色發現，去卵巢小鼠內臟脂肪組織脂肪細胞較假手術組肥大，而女貞子水提液能夠抑制小去卵巢小鼠的脂肪細胞肥大。研究也發現，女貞子水提液的主要成分之一紅景天苷能夠下調高脂誘導的肥胖大鼠附睪脂肪組織中PPARγ和C/EBPαmRNA表達，從而改善脂代謝紊亂[24]。紅景天苷也能夠抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化和脂肪的生成，其與抑制PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和adiponectin等脂肪生成轉錄因子的表達有關[25]。本研究結果顯示，女貞子水提液能夠明顯降低去卵巢小鼠內臟脂肪組織中C/EBPα和PPARγ的蛋白表達水平，說明女貞子水提液具有改善去卵巢小鼠脂肪代謝的作用，而紅景天苷可能是其物質基礎之一。

研究發現，女貞子水提液主要成分之一紅景天苷能夠激活Wnt/β-catenin信號通路，從而誘導小鼠骨髓間充質干細胞向神經元細胞的定向分化[26]。此外，Li等[27]發現紅景天苷能夠通過Wnt/β-catenin信號通路促進脂肪干細胞成骨分化。本課題組前期研究也發現女貞子能夠通過激活去卵巢大鼠骨組織Wnt/β-catenin信號通路，改善骨質量[19]。本研究結果顯示，女貞子水提液能逆轉去卵巢小鼠內臟脂肪組織中Wnt 10b和p-β-catenin/β-catenin的變化。以上結果說明，女貞子水提液可能通過調控Wnt/βcatenin信號通路來抑制去卵巢小鼠脂肪細胞的增殖和分化，進而發揮抗肥胖作用。本課題組也發現女貞子水提液中主要含有紅景天苷、女貞苷、麥角甾苷、特女貞苷和橄欖苦苷酸等主要成分[18]，但是這些成分是否具有抗去卵巢小鼠肥胖的作用尚需進一步研究。

綜上所述，女貞子水提液能夠改善去卵巢誘發的肥胖小鼠的血脂代謝，抑制白色脂肪過度生成，其作用機制可能與調節Wnt/β-catenin信號通路有關。本研究為女貞子的抗肥胖臨床應用提供了一定的科學依據，同時對其他抗肥胖藥物的機制研究提供了策略。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突