擬康定烏頭和林地烏頭中二萜生物堿類化學成分研究

韓 萌 ，王騰飛，單連海，陳 琳 ，黃 帥 ，周先禮 *

1.西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 610031

2.西南交通大學宜賓研究院，四川 宜賓 644004

毛茛科（Ranunculaceae）烏頭屬AconitumL.植物在全世界共有300余種，我國是該屬植物資源最豐富的國家，大約有200種，主要分布于我國四川、云南、西藏及東北等地[1]。烏頭屬植物在我國藥用歷史上早有記載，常用于治療風寒濕痹、關節疼痛、內分泌失調等疾病[2]。研究表明，二萜生物堿（diterpenoid alkaloids，DAs）是烏頭屬植物的特征性成分[3]，具有多種藥理活性。其中，高烏甲素（lappaconitine）、草烏甲素（bulleyaconitine A）和3-乙酰烏頭堿（3-acetylaconitine）已廣泛應用于臨床治療各種疼痛[4]。因此，烏頭屬植物有巨大的研究研究價值。擬康定烏頭A.rockiiFletcher et Lauener為毛茛科烏頭屬植物，主產于我國云南中甸，生于海拔3900～4100 m山地矮杜鵑灌叢中或灌叢邊[5]，目前已經從該種植物中分離得到36個單體化合物，包括31個烏頭堿型C19-二萜生物堿、2個7,17斷裂型C19-二萜生物堿、1個海替生型C20-二萜生物堿、1個瓦那文型C20-二萜生物堿和1個雙二萜型二萜生物堿，其中 ludaconitine、indaconitine、transconitine B和14-benzoylneoline表現出較好的拒食活性[6-8]。林地烏頭A.nemorumPopov是毛茛科烏頭屬烏頭亞屬植物，分布于中國新疆地區以及哈薩克斯坦等地，生于海拔2060～3000 m山地草坡或云杉下[5]，其塊根有劇毒，炮制后具有祛風散寒、止痛等功效[9-10]，目前已從該種植物中分離得到7個化合物，包括5個烏頭堿型C19-二萜生物堿和2個吶哌啉型C20-二萜生物堿[11-12]。擬康定烏頭和林地烏頭為烏頭屬植物，均含有結構復雜、活性多樣的特征性二萜生物堿，但目前對該2種植物化學成分研究都不夠徹底，為了豐富烏頭屬植物的化學成分結構類型，為后續開展相關生物活性研究提供物質基礎，因此本實驗對這2種植物的化學成分進行了進一步研究，從擬康定烏頭中分離鑒定了6個二萜生物堿，其中包括1個新的烏頭堿型C19-二萜生物堿，命名為擬康定烏堿甲（rockiitine A，1），以及5個已知的二萜生物堿，分別為工布烏堿（kongboendine，2）、大渡烏堿（franchetine，3）、膝烏寧堿甲（genicunine A，4）、滇烏堿（yunaconitine，5）和黃烏生（vilmorisine，6），化合物2～6為首次從擬康定烏頭中分離得到；從林地烏頭中分離得到10個化合物，分別鑒定為塔拉薩敏（talatisamine，7）、14-乙酰塔拉薩敏（14-acetyltalatisamine，8）、卡馬考寧（cammaconine，9）、16-epipyroaconine（10）、烏頭堿（aconitine，11）、3-脫氧烏頭堿（3-deoxyaconitine，12）、牛扁堿（lycoctonine，13）、甲基牛扁堿（methyllycaconitine，14）、德爾色明甲（delsemine A，15）、德爾色明乙（delsemine B，16）。其中，化合物9～16為首次從該植物中分離得到。

1 儀器與試藥

FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀（天津港東科技股份有限公司；Bruker AV 400，Bruker AV 600核磁共振儀（德國Bruker公司）；Acquity UPLC/Xevo G2-S TOF mass-超高效液-質聯用儀（Waters）；島津LCMS-8040；RE-2000A-旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；Perkin-Elmer 341-旋光光度計（Perkin-Elmer公司）、優普UPT-I-20L落地式純水機（四川優普超純科技有限公司）、ZF-20 C型紫外光譜儀、電子分析天平（托利多上海儀器有限公司）。薄層色譜硅膠GF254（青島海洋化工廠）、硅膠H（青島海洋化工廠）、堿性氧化鋁（100～200目，天津致遠化學試劑公司）和ODS-18反相硅膠（40～60μm，Merck公司）。

擬康定烏頭于2018年8月采自云南麗江中甸縣，經云南中醫學院李國棟教授鑒定為擬康定烏頭A.rockiiFletcher et Lauener，標本（2018HS0802）留存于西南交通大學生命科學與工程學院；林地烏頭于2015年8月采自新疆烏魯木齊后峽及伊犁阿合牙孜溝，由中國科學院植物華南園楊親二研究員鑒定為林地烏頭A.nemorumPopov，標本（C.Ren & L.Wang 825）保存于中國科學院華南植物園。

2 提取與分離

將擬康定烏頭根塊（10.9 kg）粉碎后，用95%乙醇冷浸5次，每次7 d，濾液減壓濃縮得總浸膏1.0 kg，用溫水溶解后加入稀鹽酸調pH至2～3，用石油醚進行4次萃取，每次3.0 L，減壓濃縮后得到石油醚部分。水溶液用氨水調pH至9～10，二氯甲烷萃取至無生物堿，減壓濃縮萃取液，得到總生物堿150.0 g。采用正相硅膠柱色譜（石油醚-醋酸乙酯100∶1～0∶1梯度洗脫）將總生物堿分為6個部分A～F。對F部分進行硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇90∶1～0∶1），進行梯度洗脫得6個部分F1～F6。F2部分通過硅膠柱色譜（石油醚-丙酮80∶1～1∶1+1%二乙胺），得到2個部分F2-1和F2-2；F2-2部分通過硅膠柱色譜（石油醚-丙酮50∶1～2∶1+1%二乙胺）得到化合物2（16.0 mg）和3（15.0 mg）；F3部分通過硅膠柱色譜（石油醚-丙酮60∶1～1∶1+1%二乙胺）得到化合物5（11.0 mg）；F4部分通過硅膠柱色譜（石油醚-丙酮50∶1～1∶1+1%二乙胺）得到3個部分F4-1～F4-3，F4-1經硅膠柱色譜（石油醚-醋酸乙酯50∶1～1∶1+1%二乙胺）得化合物6（20.3 mg）。F5部分通過硅膠柱色譜（石油醚-丙酮30∶1～1∶1+1%二乙胺）得到2個部分F5-1～F5-2，F5-1經反相柱色譜（甲醇-水5∶1）得到化合物1（9.0 mg），F6部分用硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇70∶1～0∶1）得到3個部分F6-1～F6-3，F6-2部分用堿性氧化鋁柱色譜（氯仿-甲醇18∶1），得到化合物4（13.0 mg）。

林地烏頭（5.0 kg）提取方法同上，得到總生物堿6.6 g。生物總堿經硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇1∶0～0∶1）得到3個部分I～III。I部分經反復硅膠柱色譜（石油醚-丙酮-二乙胺40∶1∶0.1～15∶1∶0.1）得到化合物10（5.0 mg）、11（10.0 mg）和12（6.0 mg）。II部分通過反復硅膠柱色譜（石油醚-丙酮-二乙胺10∶1∶0.1～5∶1∶0.1）得到8（220.0 mg）、7（160.0 mg），再經氧化鋁柱色譜（氯仿-甲醇120∶1）得到化合物13（13.0 mg）。III部分通過反相硅膠柱色譜（甲醇-水25∶75～50∶50）得到化合物9（15.0 mg）、14（7.0 mg）、15和16（11.0 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：白色無定形粉末，[α]20D+21.6°（c0.20，CHCl3），通過HR-ESI-MS推測其分子式為C33H47NO7（m/z570.351 8 [M+H]+，計算值570.353 7，C33H48NO7）。紅外光譜表明該化合物結構中具有芳環（1603、1491、1451 cm?1）和酯羰基（1721 cm?1）。1H-和13C-NMR圖譜顯示該化合物結構中具有1個氮乙基 [δH1.08 (3H, t,J= 7.2 Hz), 2.46 (1H, m),2.50 (1H, m)；δC13.6 q, 49.1 t]，1個苯甲酰氧基 [δH7.52 (1H, t,J= 7.8 Hz), 7.42 (2H, t,J= 7.2 Hz), 8.07(2H, d,J= 7.2 Hz)；δC131.0 s, 132.6 d, 129.9 d×2,128.3 d×2, 166.7 s]，5個甲氧基 [δH3.13, 3.26, 3.30(各3H, s), 3.31 (6H, s)；δC48.5 q, 56.4×2 q, 58.7 q,59.3 q]。該化合物共有33個碳原子，除上述取代基團外，13C-NMR結合DEPT譜圖可知剩余的19個碳信號中包含6個亞甲基（δC26.6, 35.0, 29.7, 35.5,80.4, 54.1）、10個次甲基（δC38.2, 45.2, 45.7, 48.6×2,61.3, 76.3, 83.2, 85.5, 83.4）和3個季碳（δC39.1, 50.8,78.5）（表1）。以上結構信息表明，化合物1是具有1個氮乙基、5個甲氧基和1個苯甲酰氧基取代的烏頭堿型C19-二萜生物堿[13]。仔細分析HMBC圖譜可知（圖1），δH3.26, 3.31, 3.13 (各3H, s)分別與δC85.5 (d),δC83.3 (d),δC78.5(s) 存在遠程相關，δH3.31 (6H, s) 與δC83.2 (d)、δC80.4 (t) 相關，證明5個甲氧基分別位于C-1、C-6、C-8、C-16和C-18位。進一步分析HMBC圖譜，δH5.01 (1H, t,J= 4.8 Hz) 與酯羰基（δC166.7 s）、C-16（δC83.4 d）、C-8（δC78.5 s）有遠程相關，證明苯甲酰氧基連接在C-14位。

圖1 化合物1的結構及關鍵1H-1H COSY、HMBC (a) 和NOESY (b) 相關Fig.1 Key 1H-1H COSY, HMBC (a), NOESY (b) correlations of compound 1

表1 化合物1的核磁數據 (600/150 MHz, CDCl3)Table 1 NMR data of compound 1 (600/150 MHz, CDCl3)

化合物1的立體構型通過NOESY確定（圖1）。Hβ-10與H-14、H-1，Hβ-9與H-6，Hα-17與H-16有遠程相關，說明1-OCH3、6-OCH3與14-OBz為α型，16-OCH3為β型。因此，確定了化合物1的結構（圖1），命名為擬康定烏堿甲（rockiitine A）。

化合物2：無色固體，分子式為C32H43NO7。HR-ESI-MSm/z: 554.371 3 [M+H]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.01 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-2′, 6′),6.91 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-3′, 5′), 5.76 (1H, d,J= 5.6 Hz, H-7), 5.11 (1H, d,J= 4.8 Hz, H-14β), 3.25, 3.28,3.36, 3.85 (各3H, s, 4×OCH3), 1.01 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3)；13C-NMR數據見表2。以上數據與文獻報道一致[14]，故鑒定化合物2為kongboendine。

化合物3：無色固體，分子式為C31H41NO6。HR-ESI-MSm/z: 524.305 2 [M+H]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.05 (2H, d,J= 8.2 Hz, H-2′, 6′),7.54 (1H, dd,J= 10.6, 4.4 Hz, H-4′), 7.43 (2H, t,J=7.8 Hz, H-3′, 5′), 5.77 (1H, d,J= 5.2 Hz, H-7), 5.14(1H, d,J= 4.8 Hz, H-14β), 4.40 (1H, d,J= 6.2 Hz,H-6), 3.24, 3.36, 3.28 (各3H, s, 3×OCH3), 1.01 (3H,t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3)；13C-NMR數據見表2。以上數據與文獻報道基本一致[15]，故鑒定化合物3為franchetine。

化合物4：白色粉末, 分子式為C22H35NO4。HR-ESI-MSm/z: 378.463 7 [M+H]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.07 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3),3.28 (3H, s, OCH3), 3.85 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-16α),4.25 (1H, t,J= 5.2 Hz, H-14β)；13C-NMR的數據見表2。以上數據與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物4為genicunine A。

化合物5：白色粉末，分子式為C35H49NO11。HR-ESI-MSm/z: 660.265 4 [M+H]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.09 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3),1.32 (3H, s, 8-OCOCH3), 3.14, 3.24, 3.28, 3.53, 3.85(各3H, s, 5×OMe), 4.86 (1H, d,J= 5.0 Hz, H-14β),6.92 (2H, d,J= 7.4 Hz, H-2′, 6′), 8.01 (2H, d,J= 7.4 Hz, H-3′, 5′)；13C-NMR數據見表2。上述數據與文獻報道基本一致[17]，故鑒定化合物 5為yunaconitine。

化合物6：白色粉末，分子式為C26H39NO6。HR-ESI-MSm/z: 462.285 6 [M+H]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.05 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3),5.67 (1H, d,J= 6.0 Hz, H-7), 4.89 (1H, brs, H-14),3.26, 3.18和3.22 (3H, s, 3×OCH3)；13C-NMR數據見表2。上述數據與文獻報道基本一致[15]，故鑒定化合物6為vilmorisine。

化合物7：白色粉末，分子式C24H39NO5。ESI-MSm/z: 422.29 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.06 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.36,3.32, 3.28 (各 3H, s, 3×OMe), 2.07 (3H, s,14-OCOCH3)；13C-NMR的數據見表2。以上數據與文獻報道基本一致[18]，故鑒定化合物 7為talatisamine。

化合物8：白色粉末，分子式C26H41NO6。ESI-MSm/z: 464.30 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.09 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.31,3.30, 3.28 (各3H, s, 3×OCH3)；13C-NMR的數據見表2。以上數據與文獻基本一致[19]，故鑒定化合物8為14-acetyltalatisamine。

表2 化合物2～8的13C-NMR數據 (100 MHz, CDCl3)Table 2 13C-NMR data of compounds 2—8 (100 MHz, CDCl3)

化合物9：白色粉末，分子式C23H37NO5。ESI-MSm/z: 408.27 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.09 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.36,3.28 (各3H, s, 2×OMe）；13C-NMR的數據見表3。以上數據與文獻報道一致[20]，故鑒定化合物9為cammaconine。

化合物10：白色粉末，分子式C25H39NO8。ESI-MSm/z: 482.27 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.06 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.74,3.30, 3.28, 3.22 (各3H, s, 4×OMe)；13C-NMR的數據見表3。上述數據與文獻報道基本一致[21]，故鑒定化合物10為16-epipyroaconine。

化合物11：白色粉末，分子式C34H47NO11。ESI-MSm/z: 646.32 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.10 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.30,3.27, 3.17 (各3H, s, 3×OMe), 7.46 (2H, t,J= 7.2 Hz,H-3′, 5′), 7.57 (H, t,J= 7.2 Hz, H-4′), 8.03 (2H, d,J=7.2 Hz, H-2′, 6′)；13C-NMR的數據見表3。以上數據與文獻報道一致[22]，故鑒定化合物11為aconitine。

表3 化合物9～16的13C-NMR數據 (150 MHz, CDCl3)Table 3 13C-NMR data of compounds 9—16 (150 MHz, CDCl3)

化合物12：白色粉末，分子式C34H47NO10。ESI-MSm/z: 630.32 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.07 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.26,3.15 (各3H, s, 2×OMe), 7.45 (2H, t,J= 7.2 Hz, H-3′,5′), 7.56 (1H, t,J= 7.2 Hz, H-4′), 8.02 (2H, d,J= 7.2 Hz, H-2′, 6′)；13C-NMR的數據見表3。以上數據與文獻報道一致[23]，故鑒定化合物 12為3-deoxyaconitine。

化合物13：白色粉末，分子式C25H41NO7。ESI-MSm/z: 468.29 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.09 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.54,3.37, 3.26, 3.08 (各3H, s, 4×OMe)；13C-NMR的數據見表3。以上數據與文獻報道基本一致[24]，故鑒定化合物13為lycoctonine。

化合物14：白色粉末，分子式C37H50N2O10。ESI-MSm/z: 683.35 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.10 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.45,3.40, 3.36, 3.26 (各3H, s, 4×OMe)；13C-NMR的數據見表3。以上數據與文獻報道基本一致[24]，故鑒定化合物14為methyllycaconitine。

化合物15和16：白色粉末，分子式C37H53N3O10。ESI-MSm/z: 700.38 [M+H]+；1H-NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 1.08 (3H, t,J= 7.2 Hz, H-22),11.09/11.13 (1H, brs, NH), 8.65 (1H, m, H-3′), 7.95(1H, m, H-6′), 7.75 (1H, m, H-4′), 7.08 (1H, m, H-5′）；13C-NMR的數據見表3。以上數據與文獻報道[25]相符，故鑒定化合物15和16為一對區域異構二萜生物堿的混合物，即delsemine A和B。

4 討論

本研究從擬康定烏頭和林地烏頭中共分離鑒定16個化合物，包括1個新的烏頭堿型C19-二萜生物堿和15個已知化合物（化合物2～16），包括3個7,17斷裂型C19-二萜生物堿、9個烏頭堿型C19-二萜生物堿和3個牛扁堿型C19-二萜生物堿，符合肖培根教授提出的顯柱烏頭系和準噶爾烏頭系生物堿成分特征[26]。該研究進一步豐富了2種藥用草烏的化學成分研究，為其植物化學分類提供了參考依據，也為后續開展相關生物活性研究提供了一定的物質基礎。研究表明，C19-二萜生物堿通常具有抗腫瘤、抗炎和殺蟲等生物活性[27-29]，因此后期擬對分離所得化合物進行相關活性測定，為天然產物的開發利用提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突