氣相色譜法測定食品中4種對 羥基苯甲酸酯類含量

◎ 燕 群，黨翠紅，張 育

（咸陽市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 咸陽 712000）

對羥基苯甲酸酯又稱尼泊金酯，包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯等，是一類高效的防腐劑，對霉菌、酵母及細菌有廣泛的抗菌作用，其抗菌作用比苯甲酸、山梨酸強，在食品、飲料、化妝品和醫藥等許多行業廣泛應用[1-3]。對羥基苯甲酸酯類的作用機制基本上與苯酚類類似，能夠破壞微生物的細胞膜，使細胞內蛋白質變性，并抑制微生物細胞的呼吸酶系和電子傳遞酶系的活性。與傳統的苯甲酸、山梨酸防腐劑相比，對羥基苯甲酸酯類的防腐效果不易隨pH值的變化而變化，在堿性環境下尚有效，而且其毒性遠低于苯甲酸鈉和山梨酸鉀[4]。嚴格按照標準劑量添加對人體無害，然而過量使用可能會產生類雌激素風險，導致內分泌系統紊亂，對人體產生一定的毒副作用，威脅人體健康，因此對食品中對羥基苯甲酸酯類的檢測尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食醋、醬油、茶飲料（均購于超市）；無水乙醇（色譜純，美國默克兩合股份有限公司）；無水乙醚、鹽酸、氯化鈉、無水硫酸鈉和碳酸氫鈉（分析純，天津科密歐化學試劑有限公司）；對羥基苯甲酸甲酯（99.9%，CAS號：99-76-3）、對羥基苯甲酸乙酯（99.5%，CAS號：120-48-7）、對羥基苯甲酸丙酯（99.7%，CAS號：94-13-3）和對羥基苯甲酸丁酯（99.8%，CAS號：94-26-8），CATO Research Chemicals Inc。

1.2 儀器與設備

氣相色譜儀，GC-2010 Plus（日本島津有限公司），配氫火焰離子化檢測器（FID），InterCap 5毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，日本島津有限公司）；AUY-120電子天平(日本島津有限公司)；氮吹儀（天津市恒奧科技發展有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

進樣口氣化室溫度：220 ℃；分流比10∶1；線速模式74.9 MPa；檢測器：FID 溫度260 ℃；升溫程序：100 ℃保持1 min，以20 ℃·min-1升到170 ℃，以 12 ℃·min-1升到220 ℃，保持1 min，以10 ℃·min-1升到250 ℃，保持6 min；載氣流量：氫氣40.0 mL·min-1，空氣400.0 mL·min-1，尾吹流量40.0 mL·min-1。

1.3.2 標準溶液配制

分別準確稱取對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯標準品各0.5 g（精確至0.1 mg）于4個25 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，得到濃度為20 mg·mL-1的單標儲備液。然后再分別吸取2.5 mL單標儲備液于50 mL容量瓶中，無水乙醇稀釋并定容至刻度，得到濃度為1 mg·mL-1的混合標準中間液，臨用時配制。再將混合標準中間液稀釋為1.0 μg·mL-1、1.5 μg·mL-1、 2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、 20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1的混合標準系列工作液，臨用時配制。

1.3.3 樣品前處理

稱取均質后的樣品5 g（精確至0.01 g）于小燒杯中，并轉移至分液漏斗中，用飽和氯化鈉溶液分次洗滌小燒杯并將洗滌液轉移至分液漏斗中，加入1 mL鹽酸（1∶1）酸化，搖勻，再分別以75 mL、50 mL、50 mL無水乙醚提取3次，合并乙醚層于另一分液漏斗中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液洗滌一次，再以碳酸氫鈉溶液30 mL、30 mL、30 mL洗滌3次，棄去水層，將有機層經過無水硫酸鈉濾入濃縮瓶中，旋蒸濃縮近干，氮吹除去溶劑殘留，準確加入2.0 mL無水乙醇溶解殘留物，過膜、上機、待測[5]。

1.3.4 檢出限評估

（1）目視評價法評估檢出限。目視評估法是通過在樣品空白中添加已知濃度的分析物，然后確定能夠可靠檢測出分析物最低濃度值的方法[6]。參考標準《食品安全國家標準 食品中對羥基苯甲酸酯類的測定》（GB 5009.31—2016），對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯的檢出限均為0.6 mg·kg-1。稱取基質樣品（醬油）2份各0.5 g（精確至0.01 g），分別加入20 μL、30 μL對羥基苯甲酸酯類混合標準中間液（100 μg·mL-1），即加入的對羥基苯甲酸酯類的含量為0.4 mg·kg-1、 0.6 mg·kg-1，經樣品前處理分析后，進氣相色譜儀分析，連續測定7次，按照以下公式計算檢出限：

式中：Xi為試樣中對羥基苯甲酸的含量，mg·kg-1；C為由標準曲線計算出進樣液中對羥基苯甲酸脂類的濃度，μg·mL-1；m為試樣質量，g；V為定容體積，mL；f為換算系數。

（2）信噪比法評估檢出限。對于定量方法來說，由于儀器分析過程都會有背景噪音，常用已知低濃度的分析物樣品與空白樣品的測量信號進行比較，確定可靠的最小檢出濃度。典型的可接受的信噪比是2∶1或3∶1[6]，本次檢出限以3倍信噪比計。按照以下公式計算檢出限：

式中：LOD為檢出限，mg·kg-1；C為試樣中對羥基苯甲酸脂類的濃度，μg·mL-1；S/N為試樣中對羥基苯甲酸脂類濃度對應的儀器信噪比。

2 結果與分析

2.1 色譜圖

在上述色譜條件下，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯的出峰順序和保留時間見圖1，可以看出分離效果好，響應值大，能較好地定性。

2.2 檢出限分析

參考《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）中5.4.2.2確定檢出限的方法，本次選擇目視評價法和信噪比法評估檢出限。

表1為添加量為0.4 mg·kg-1的測定結果，表2為添加量為0.6 mg·kg-1的測定結果，表3為兩種方法結果比較，經綜合評估，選用較大的值作為檢出限。對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯的檢出限分別為0.489 8 mg·kg-1、 0.400 0 mg·kg-1、0.400 0 mg·kg-1和0.400 0 mg·kg-1，均小于GB 5009.31—2016的方法檢出限。

表1 添加量為0.4 mg·kg-1的測定結果表（n=7）

表2 添加量為0.6 mg·kg-1的測定結果表（n=7）

表3 兩種方法檢出限結果比較表

2.3 校準曲線

分別取混合標準系列工作液上機測定，4種對羥基苯甲酸酯類的峰面積和質量濃度在0~100 μg·mL-1呈現良好的線性關系。相關系數均符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）附錄 F.2校準曲線[7]不低于0.99的規定。其線性關系良好，可以較好的用于定量分析。數據如表4所示。

表4 4種對羥基苯甲酸酯類的峰面積及相關系數表

2.4 加標回收率

稱取樣品，對3種樣品在3個添加水平下加標，同等條件下重復測定兩次，計算RSD。按照1.3.3進行前處理，加標回收率及RSD見表5。結果顯示，3種樣品在3個添加水平下能得到較高的加標回收率，為91.0%～101.0%，符合GB/T 27404—2008附錄F.1回收率[7]的規定，且RSD值較小，能滿足定量檢測的要求。

表5 4種對羥基苯甲酸酯類加標回收率表

2.5 精密度

對同一濃度點5.0 μg·mL-1混合標準溶液平行測定7次，數據見表6。實驗室內變異系數CV/符合 GB/T 27404—2008附錄F.3精密度的規定[7]。

表6 4種對羥基苯甲酸酯類精密度表（n=7）

3 結論

用氣相色譜毛細管柱法測定食品中對羥基苯甲酸酯類，結果顯示對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯的校準曲線相關系數分別為0.999 8、0.999 8、0.999 9和0.999 9；檢出限分別為0.489 8 mg·kg-1、0.400 0 mg·kg-1、0.400 0 mg·kg-1和0.400 0 mg·kg-1；精密度分別為0.93%、1.54%、1.99%和0.83%；加標回收率為91.2%～101.0%，符合 GB/T 27404—2008和GB/T 27417—2017的要求。表明該方法分離效率高、分析結果準確，可以適用于食品中對羥基苯甲酸酯類的檢測。