針灸對自然衰老圍絕經期大鼠雌激素水平及單胺類神經遞質的影響

權興苗 王月 宋春俠 范麗潔 時菁靜 劉玉蘭 徐立偉

(1承德醫學院附屬醫院中醫科，河北 承德 067000；2河北中醫學院)

圍絕經期綜合征(PMS)是由于生理或病理引起機體發生變化導致卵巢損傷或功能衰竭，使雌激素分泌減少，導致組織發生變化的退行性病變〔1〕。研究發現〔2〕，神經遞質、激素和細胞因子失衡是PMS發生的主要原因，機體雌激素水平下降，影響單胺類神經遞質的合成，可引發腦組織損傷，增加圍絕經期抑郁癥發生的風險。PMS的病因復雜，目前臨床通常采用雌激素替代療法治療PMS，但長期使用雌激素會增加子宮內膜癌和乳腺癌發生的風險〔3，4〕。針灸治療在神經和免疫等方面對全身具有宏觀調控作用，具有安全、無痛、高效、快捷和適應性廣等優點〔5〕。目前采用針灸治療自然衰老圍絕經期的機制研究尚淺，本研究主要通過自然衰老大鼠作PMS模型，觀察針灸刺激雙側腎俞、三陰交和神門對大鼠腦組織去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(HT)、雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)水平的影響，探討針灸療法對圍絕經期的神經保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 12～14月齡雌性SD大鼠30只，體重(300±20)g，陰道細胞涂片連續15 d監測未發現動情期變化，根據陰道分泌物和細胞學變化顯示大鼠符合圍絕經期變化規律〔6〕。同時選取健康4～6月齡雌性SD大鼠10只作為對照組，體重(220±20)g，均由河北省中西醫結合醫藥研究院提供，合格證號：SYXK(冀)2014-0033。飼養室溫(22±2)℃，濕度65%，自由攝食、飲水，適應性飼養1 w。

1.2主要試劑和儀器 E2、FSH、LH放射免疫分析試劑盒購自上海滬震生物科技有限公司；NE、DA和5-HT標準品購自美國Sigma公司。CKX53倒置生物顯微鏡(廠家：日本Olympus公司)；e2695型高效液相色譜儀(廠家：美國Waters公司)；life2720型PCR熱循環儀(廠家：美國ABI公司)；DYCZ-30C型雙板夾芯式垂直電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3動物分組和給藥 將30只大鼠隨機分為模型組、陽性對照組和治療組。將大鼠束縛，治療組根據大鼠穴位圖譜取雙側腎俞、三陰交和神門，腎俞位于第二腰椎后兩旁，左右各一，刺入背闊肌、骼肋肌溝內，直刺6 mm；三陰交位于后肢內踝尖直上方1 cm，左右各一，刺入趾身屈肌，直刺5 mm；神門位于前肢內側腕部橫紋尺骨邊緣，左右各一，刺入腕尺側屈肌，之刺1 mm〔7〕；留針20 min，隔天1次，共15次，其余各組不進行刺激，但處理包括捆綁、脫毛等與實驗組相同。陽性對照組灌胃給予尼爾雌醇1.5 mg/kg，1 d/次。其余各組給予等量生理鹽水，1 d/次，連續4 w。

1.4曠場實驗(OFT)測定行為學變化 OFT 取大鼠置于安靜房間曠場反應箱(100 cm×100 cm×40 cm)，內壁涂黑，底面平均劃分小格。記錄大鼠在曠場內3 min 內穿越底面格數(四爪均進入方格方可計數)的水平活動得分(穿越1格計 1分，沿線行走每8 cm 計1分)及后肢直立次數(兩前爪騰空或攀附墻壁)的垂直活動得分(雙前足離地1次為1分)。

1.5大鼠卵巢組織蘇木素-伊紅(HE)染色 處死大鼠后摘取卵巢組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規脫水，包埋，切片，片厚5 μm，常規脫蠟至水，蘇木素染色10 min，0.5%鹽酸乙醇分化2 s，伊紅染色5 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察卵巢組織黃體、卵泡和卵泡膜細胞等結構及形態學變化。

1.6放射免疫分析法測定E2、FSH和LH水平 各組大鼠末次治療后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血4 ml，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心5 min，分離血清，測定E2、FSH和LH水平，實驗步驟嚴格按照放射免疫分析試劑盒說明書方法進行。

1.7單胺類神經遞質的測定 處死大鼠后迅速取腦，稱重，加入2 ml 0.1 mol/L HClO4溶液，制作腦組織勻漿，于4℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試品溶液。另取NE、DA和5-HT對照品適量，采用HPLC-ECD法測定混合對照品溶液峰面積，繪制標準曲線，取供試品溶液進樣，計算含量。

1.8統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組OFT水平及垂直運動得分比較 給藥前，與對照組比較，模型組水平及垂直活動得分明顯下降(P<0.05)。給藥后，與模型組比較，陽性對照組和治療組水平及垂直活動明顯增加(P<0.05)；陽性對照組和治療組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組水平及垂直活動得分比較分)

2.2各組卵巢組織形態學變化情況 對照組卵巢組織黃體發育良好，體積較大，可見多個成熟卵泡。模型組卵巢組織黃體數目少，成熟卵泡少，閉鎖卵泡較多，表現為卵巢萎縮。陽性對照組和治療組可見成熟卵泡，卵巢萎縮現象明顯改善。見圖1。

圖1 各組卵巢組織HE染色結果(×400)

2.3各組單胺類神經遞質含量比較 與對照組比較，模型組腦組織NE和DA含量明顯降低，5-HT含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組和治療組腦組織NE和DA含量明顯升高，5-HT含量明顯降低(P<0.05)；陽性對照組和治療組腦組織NE、DA和5-HT含量比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表2。

圖2 各組單胺類神經遞質HPLC圖

表2 各組血清NE、DA和5-HT含量比較

2.4各組性激素水平比較 與對照組比較，模型組血清E2水平明顯降低，血清FSH和LH水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和治療組血清E2水平明顯升高(P<0.05)，血清FSH和LH水平均明顯降低(P<0.05)；陽性對照組和治療組E2和FSH水平差異無統計學意義(P>0.05)，LH水平差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組血清E2、FSH和LH水平比較

3 討 論

PMS在中醫范疇里屬于絕經前后諸證，認為是由于陰血虧虛，腎水不足，導致腎臟陰陽平衡失調引起病變〔8〕。腎為沖任之本，腎陰虛則精虧血少，腎陽虛則虛寒內生，對此，本研究通過刺激腎俞和三陰交，達到壯元陽，助運化的目的。腎俞穴歸屬足太陽膀胱經，有補腎助陽、調節生殖功能；三陰交屬足太陰脾經，為足三陰經之匯，是調理肝脾腎的要穴，針灸二穴能夠補肝益腎，調和營血〔9〕。神門系心氣出入之門，為手少陰心經之腧穴，原穴，針灸神門可開心氣，安定神智〔10〕。采用針灸刺激可激活相應的中樞神經系統，調控下丘腦-內分泌，繼而影響靶器官。

卵巢是女性的性腺器官，具有排卵和產生雌激素、孕激素及雄激素的功能，卵巢功能衰退是圍絕經期婦女卵巢分泌卵泡數量減少、性激素合成不足、血清雌激素水平下降的主要原因，激素水平下降會導致下丘腦和垂體等神經功能衰退，引起內分泌失調〔11，12〕。雌激素中以E2的活性最高〔13〕。在機體病理狀態下E2分泌減少，會促進腺垂體和釋放促性腺激素合成，引起內分泌功能紊亂，導致機體內環境異常，其中促性腺激素包括FSH和LH〔14〕。FSH具有促進卵泡的生長發育及生殖細胞成熟〔15〕，LH具有促進黃體酮分泌的作用〔16〕。單胺類神經遞質的含量變化受到激素水平的影響，二者存在相關關系〔17〕，因此圍絕經期婦女更容易出現心理疾病。本研究結果說明自然衰老大鼠血清雌激素分泌減少，會導致下丘腦-垂體-卵巢軸之間平衡失調，促進FSH及LH分泌。另外說明針灸刺激雙側腎俞、三陰交和神門，能夠通過下丘腦-垂體-卵巢軸調節自然衰老圍絕經期模型大鼠雌激素水平。此外，針灸刺激以上穴位能夠刺激機體調節單胺類神經遞質水平，起到一定抗抑郁作用。

綜上，針灸雙側腎俞、三陰交和神門，能夠調節自然衰老圍絕經期模型大鼠雌激素水平，調節腦組織單胺類神經遞質水平，改善圍絕經期引起的抑郁行為。