基于網絡藥理學研究黃芩清熱除痹膠囊治療骨關節炎的分子機制

周 巧， 劉 健， 郭錦晨， 黃 旦

(1.安徽省中醫藥科學院中醫風濕病防治研究所，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第二附屬醫院，安徽 合肥 230061；3.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031)

骨關節炎的發病因素包括衰老、機械壓力、遺傳和肥胖[1]。骨關節炎中主要穩態細胞的損害，導致氧化應激反應，細胞功能障礙和衰老[2]。骨關節炎屬中醫“骨痹”范疇，中醫學病機呈現脾虛濕盛、濕熱蘊結，痰瘀痹阻，可采用“健脾化濕、清熱通絡”進行治療，黃芩清熱除痹膠囊為安徽中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，具有健脾化濕、清熱通絡之功。本課題組前期臨床研究和細胞實驗發現，黃芩清熱除痹膠囊可改善骨關節炎患者臨床癥狀，調節促-抑炎體系，發揮抗氧化作用，從而起到治療骨關節炎的作用[3]。

網絡藥理學作為一種新的科學方法，分析網絡數據和系統生物學是網絡藥理學的基礎，與中醫的結合彌補了現代醫學與傳統醫學之間的鴻溝[4]。本研究基于網絡藥理學，篩選出黃芩清熱除痹膠囊活性成分及作用靶點，挖掘黃芩清熱除痹膠囊調控骨關節炎的潛在靶點，并通過生物信息學分析，構建藥物、靶點、基因、疾病網絡圖，進行相應富集分析和分子對接，探討黃芩清熱除痹膠囊治療骨關節炎可能的分子機制，為黃芩清熱除痹膠囊治療骨關節炎后續實驗研究開拓思路，為臨床應用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 黃芩清熱除痹膠囊化學成分篩選及活性成分靶點庫構建 通過檢索中藥系統藥理學分析平臺即TCMSP數據庫，檢索黃芩清熱除痹膠囊主要中藥成分黃芩、梔子、威靈仙、薏苡仁和桃仁，根據 ADME(吸收、分布、代謝、排泄)的參數，口服生物利用度(OB)的篩查閾值設置為≥30%，藥物相似度(DL)設置為≥0.18，以篩選有效活性成分。

1.2 Venn分析及藥物活性成分-潛在靶點-疾病網絡圖的構建 將黃芩清熱除痹膠囊中藥成分輸入TCMSP數據庫，限定物種是“Homosapiens”，獲得中藥化合物相關的潛在靶點基因，應用UniProt校正，建立藥物活性成分靶點基因數據庫。以“Osteoarthritis”為關鍵詞，檢索GeneCards、OMIM、Drugbank、PharmGkb、TTD數據庫，篩選條件為relevance score≥10，收集與骨關節炎相關的已知靶點基因。使用Funrich篩選中藥復方靶點和骨關節炎靶點的交集靶點，進行Venn分析。Cytoscape 3.7.2軟件構建黃芩清熱除痹膠囊活性成分-潛在靶點-疾病網絡圖。

1.3 蛋白質-蛋白質互作關系(PPI)網絡拓撲分析及核心靶點的篩選 將2組交集基因集輸入String在線數據庫，選擇“multiple proteins”分析模式，限定種屬為 “Homesapiens”，獲取蛋白與蛋白間互作信息，構建PPI作用網絡。運用Cytoscape 3.2.1軟件，使用CytoNCA插件[5]對核心網絡進行篩選。

1.4 核心靶點基因的富集分析 使用R.Data軟件，對黃芩清熱除痹膠囊治療骨關節炎的核心靶點進行基因本體論(GO)生物過程和KEGG信號通路富集分析，物種選為“Homesapiens”，以P<0.05作為篩選條件，獲取相應數據，繪制相應圖形。

1.5 活性成分與靶點的分子對接驗證 選擇主要中藥成分化合物與核心靶點進行分子對接。化合物的二維結構圖通過PubChem數據庫下載，導入到Chem3D軟件中以繪制三維結構圖，優化后保存為mol2格式，AutoDock Tools1.5.6軟件用于制備受體，包括添加氫和設置對接參數，所有配體和受體文件均保存為pdbqt格式，Autodock Vina來評估和驗證化合物-靶標關系的結合親和力，以及網絡藥理學的預測結果，綁定模型通過PyMol2.3.0軟件和Discovery Studio3.5軟件可視化。

2 結果

2.1 黃芩清熱除痹膠囊有效成分的收集和篩選 最終獲得黃芩清熱除痹膠囊活性成分90種，其中黃芩36種，梔子15種，桃仁23種，威靈仙7種，薏苡仁9種，有2種成分為2種以上中藥所共有。由于黃芩清熱除痹膠囊的活性成分較多，僅列出25項，見表1。

2.2 黃芩清熱除痹膠囊和疾病骨關節炎潛在作用靶點Venn分析及“中藥-活性成分-潛在靶點-疾病”網絡展示圖的構建 在TCMSP數據庫中檢索黃芩清熱除痹膠囊活性成分對應的靶點，共得到1 767個靶標基因，經過Uniprot將所有靶標進行匯總、去除重復靶標和標準化名稱，進行校正后，共得到202個靶標基因。通過檢索GeneCards、OMIM、Drugbank、PharmGkb、TTD數據庫，分別收集到骨關節炎相關靶點基因1 836、33、353、8、28個，去除重復基因后共獲得1 944個。對黃芩清熱除痹膠囊活性成分對應的202個共同作用靶點與1 944個骨關節炎相關靶點進行Venn分析，獲得115個交集基因，即為黃芩清熱除痹膠囊治療骨關節炎的潛在作用靶點。Cytoscape 3.7.2軟件構建“中藥-活性成分-潛在靶點-疾病”網絡展示圖，其中，左邊圓圈代表復方黃芩清熱除痹膠囊中藥的活性成分，不同顏色代表不同中藥成分，右邊網格代表活性成分的靶基因，用藍色長方形表示，節點越大，代表靶基因相連的成分越多，見圖1。

圖1 黃芩清熱除痹膠囊活性成分-作用靶點相互作用關系網絡圖

2.3 PPI網絡拓撲分析及核心靶點的篩選 將115個交集基因集輸入到Cytoscape 3.7.2軟件BisoGenet插件，構建PPI網絡，見圖2。使用CytoNCA插件計算每個網絡節點的DC值，篩選出DC>2倍DC中位數(28)的節點。篩選出EC、IC、LAC、BC、CC、NE大于各自中位數的節點，最終篩選出核心靶點11個。分別為絲裂原活化蛋白激酶1,8,14(mitogen-activated protein kinase 1,8,14)、Fos原癌基因(Fos proto-oncogene)、AP-1轉錄因子亞基(AP-1 transcription factor subunit)、雌激素受體(estrogen receptor 1，ESR1)、NFKB抑制劑α(NFKB inhibitor alpha，NFKBIA)、RELA原癌基因(RELA proto-oncogene)、NF-KB亞基(NF-KB subunit)、JUN(junctional adhesion molecule 3)、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT serine/threonine kinase 1，AKT1)、腫瘤蛋白P53結合蛋白1(tumor protein P53 binding protein 1，TP53)、MYC原癌基因(MYC proto-oncogene)、BHLH轉錄因子(BHLH transcription factor)。

表1 黃芩清熱除痹膠囊部分活性成分信息

注：左圖為初始PPI 網絡，中圖為篩選出DC>2倍DC中位數(28)的節點，右圖為最終篩選出的核心靶點。圖2 PPI網絡構建及核心靶點的篩選過程圖

2.4 核心靶點基因的富集分析 為了解交集基因在骨關節炎治療中所起的作用，對黃芩清熱除痹膠囊的11個核心靶點基因進行GO、KEGG富集分析，設定閾值P<0.05。GO注釋條目116個，按照P值升序排列的前20條GO富集結果見圖3，生物過程(biological processes，BP)主要參與對脂多糖的反應、對細菌起源分子的反應、細胞對生物刺激的反應、外在凋亡信號通路、對抗生素的反應、對活性氧的反應、細胞對氧化應激的反應；細胞組分(cellular component，CC)主要參與膜區、囊泡腔、轉錄因子復合體細胞質囊泡腔、分泌顆粒腔、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物等；分子功能(molecular function，MF)主要參與細胞因子受體結合、血紅素結合、氧化還原酶活性、氧化還原酶活性等。按照P值升序排列的前20條KEGG富集通路見圖4，黃芩清熱除痹膠囊可以作用于IL-17信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、Th17細胞分化、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等161條信號通路。此外，結果還顯示黃芩清熱除痹膠囊活性成分的靶基因還涉及其他疾病，如感染疾病、腫瘤、耐藥、內分泌與代謝病和神經退行性變等，這提示了黃芩清熱除痹膠囊活性成分治療這些疾病的潛在優勢。

圖3 GO富集分析(前20條通路)

圖4 KEGG富集分析(前20條通路)

2.5 分子對接結果分析 通過篩選的11個核心靶點，以及富集分析得到的骨關節炎相關基因和信號通路，選取有文獻報道與骨關節炎相關經典靶點蛋白7個[6-11]，在PDB和Uniprot數據庫中檢索核心靶點對應的與中藥成分相關的小分子配體，以及配體對應的蛋白信息，物種選為“Homesapiens”，見表2。利用Autodock tools軟件計算這7個靶點基因與黃芩清熱除痹膠囊中藥活性成分間的最低結合能，見表3，受體蛋白與活性成分的最低結合能結果小于-5 kcal/mol，表明結合較好，所需的能量越少，結合越穩定。部分分子對接結合模式見圖5，黃色圓圈表示小分子化合物與大分子蛋白質之間的對接狀態，綠色線條代表氫鍵。結果顯示，活性成分與靶點受體蛋白周圍分子通過氫鍵等分子間作用力形成較為穩定的構象。

表2 靶點受體蛋白信息

表3 活性成分與靶點受體蛋白間的最低結合能

注：A～D分別為梔子與ESR1、TP53、AKT1、MAPK14對接，E～F分別為黃芩與JUN、FOS對接，G為薏苡仁與MAPK1對接。圖5 活性成分與靶點受體蛋白的分子對接模式

3 討論

骨關節炎的特征是關節軟骨細胞的逐漸破壞[12]，本病中醫屬于“骨痹”范疇，其中醫學病機呈現脾虛濕盛、濕熱蘊結，痰瘀痹阻[13]，因此采用健脾化濕、清熱通絡法治療[14]。黃芩清熱除痹膠囊具有健脾化濕、清熱通絡之功，由黃芩、梔子、威靈仙、薏苡仁、桃仁組成。本研究通過TCMSP 數據庫檢索出黃芩清熱除痹膠囊的主要化學成分有90種，構建黃芩清熱除痹膠囊-活性成分-潛在靶點以及骨關節炎疾病相關靶點，通過Venn分析取兩者交集基因115個；PPI網絡篩選出核心靶點11個，包括MAPK1,8,14、AKT1、ESR1、TP53、JUN、FOS等；構建“中藥-活性成分-潛在靶點-疾病”網絡發現黃芩清熱除痹膠囊治療骨關節炎具有多成分、多靶點的特點；富集結果顯示，黃芩清熱除痹膠囊參與氧化應激的反應、活性氧的反應、凋亡信號通路、轉錄因子活性等生物過程；可以作用于IL-17信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、Th17細胞分化、PI3K-Akt信號通路等161條信號通路，由此可見，黃芩清熱除痹膠囊可以調控骨關節炎的外在凋亡信號通路、轉錄因子活性、氧化應激反應。本課題組前期臨床研究也發現，黃芩清熱除痹膠囊可通過調節促-抑炎體系，調節CD36啟動子或者PPARγ表達，進而激活AMPK磷酸化，提高細胞內Mn-SOD表達，使細胞免受氧化損傷，發揮抗氧化、抗炎、抗免疫作用，改善關節炎患者臨床癥狀[15-17]。這與本研究的富集結果相吻合。富集結果還顯示，黃芩清熱除痹膠囊活性成分的靶基因還涉及其他疾病，如感染疾病、腫瘤、耐藥、內分泌與代謝病和神經退行性變等，這提示了黃芩清熱除痹膠囊活性成分治療這些疾病的潛在優勢。

對PPI網絡拓撲分析中篩選的核心基因進行選擇，選取有文獻報道與骨關節炎相關經典靶點蛋白7個進行分子對接，分別為ESR1、TP53、AKT1、JUN、MAPK1、MAPK14、FOS，與這些靶點相關的黃芩清熱除痹膠囊成分是黃芩、梔子、薏苡仁和威靈仙，且AutoDock Tools計算出的最低結合能結果均小于-5 kcal/mol，表示結合穩定。故黃芩清熱除痹膠囊可以通過ESR1、TP53、AKT1、JUN、MAPK1、MAPK14、FOS等靶點治療骨關節炎。雌激素受體1(estrogen receptor,ESR) 是一種小分子類固醇激素，該基因多態性與膝骨關節炎發病有一定聯系，ESR1基因突變可能會增加膝骨關節炎患病風險。TP53基因編碼的p53蛋白的作用是調控細胞分裂和增殖。JUN和FOS是編碼激活蛋白-1(AP-1)的不同亞單位，含有FOS的AP-1雜二聚體被證明是軟骨細胞分化所必需的。另外，JUN表達的c-Jun蛋白對調節軟骨細胞的凋亡有重要作用[10]。MAPK蛋白等通過調控自噬相關信號通路,一方面抑制間充質干細胞向軟骨細胞轉化，減少軟骨細胞產生；一方面改變細胞生長環境促進軟骨細胞的凋亡，增加軟骨細胞的損失，而軟骨細胞數量的減少又伴隨著軟骨細胞外基質生成不足，從而促進軟骨退變[11]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學和分子對接技術，展示了黃芩清熱除痹膠囊治療骨關節炎的復雜分子網絡關系，體現了中藥復方多成分、多靶點、多通路的治病特點。研究還發現黃芩清熱除痹膠囊參與骨關節炎活性氧的反應、凋亡信號通路、轉錄因子活性等生物過程，也可以作用于IL-17信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、Th17細胞分化、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等，發揮調節免疫炎癥反應、調控細胞凋亡及調節氧化應激反應等作用來治療骨關節炎。