枯草芽孢桿菌KXZ-33與化學(xué)藥劑協(xié)同防控棉花枯萎病的效果評(píng)價(jià)

趙瑩瑩，張軍高，李 進(jìn)，梁 晶，高翔宇，顧愛星，雷 斌

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,烏魯木齊 830052；2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所/新疆作物化控調(diào)控工程技術(shù)研究中心，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌萎蔫專化型(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)通過侵染棉花纖維束而造成的系統(tǒng)性病害，是世界性土傳性病害[1]，在棉花的全生育期均可發(fā)生[2-3]。針對(duì)棉花枯萎病主要的防治有化學(xué)農(nóng)藥、種植抗病品種、與其他作物輪作等措施。化學(xué)農(nóng)藥的過度使用會(huì)造成一系列的環(huán)境問題，[4-5]，生物防治是采用真菌、細(xì)菌、放線菌，通過調(diào)節(jié)土壤環(huán)境、分泌次生代謝物、競(jìng)爭(zhēng)作用等拮抗機(jī)制達(dá)到病害防治的目的[6]。芽孢桿菌屬對(duì)多種植物病害的發(fā)生都有拮抗作用，在自然界中廣泛存在，且在不利環(huán)境下可以形成穩(wěn)定的芽孢[7]。【前人研究進(jìn)展】芽孢桿菌可以在低劑量的化學(xué)殺菌劑正常生長(zhǎng)，將芽孢桿菌與化學(xué)殺菌劑相結(jié)合，在防治棉花枯萎病等真菌性病害時(shí)可以彌補(bǔ)兩者的缺陷，在起到防治效果的同時(shí)又可以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用[8]。此策略在植物保護(hù)領(lǐng)域廣泛探討，并取得成效[9]。將枯草芽孢桿菌屬、多粘芽孢桿菌屬、貝萊斯芽孢桿菌[10]、蠟狀芽孢桿菌屬、解淀粉芽孢桿菌屬[11]、地衣芽孢桿菌[12]、甲基營(yíng)養(yǎng)性芽孢桿菌[13]等與殺菌劑成功復(fù)配。賀惠文等[12]利用地衣芽孢桿菌W10與多菌靈按照100∶1的復(fù)配比例下對(duì)桃樹褐斑病的防治效果有大幅度提升。【本研究切入點(diǎn)】因生防菌受環(huán)境、氣候、定植能力影響較大，實(shí)際大田防治效果并不理想。需開展從棉花枯萎病發(fā)病嚴(yán)重病田中，分離出有篩選出拮抗效果的生防細(xì)菌。【擬解決的關(guān)鍵問題】以棉花枯萎病主要致病菌尖孢鐮刀菌為研究對(duì)象，采用室內(nèi)平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選拮抗細(xì)菌，含毒介質(zhì)法對(duì)化學(xué)殺菌劑進(jìn)行毒力測(cè)定，篩選出與生防細(xì)菌與化學(xué)藥劑協(xié)同防治棉花枯萎病有穩(wěn)定防效的組合方式，彌補(bǔ)生防細(xì)菌在實(shí)際運(yùn)用中的防效，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，減緩植物病害抗病性的增加，為農(nóng)藥減施和綠色生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試棉花品種為979，新疆金豐源種業(yè)股份有限公司提供；供試病原菌為棉花枯萎病萎蔫專化型中等致病力的7號(hào)生理小種st89(F.oxysporum)，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。供試枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KXZ-33、KXZ-4由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室中保存，莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)Hwt-34、Twt-34，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)UB7-1和A57由新疆農(nóng)業(yè)學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所保存。供試殺菌劑：50%甲基硫菌靈可濕性粉劑(四川潤(rùn)爾科技有限公司)、80%代森錳鋅可濕性粉劑(山東鄒平農(nóng)藥有限公司)、80%乙蒜素乳油(壽光禾大壯生物科技有限公司)、50%福美雙可濕性粉劑(山東百農(nóng)思達(dá)生物科技有限公司)、30%噁霉靈可濕性乳油(四川潤(rùn)爾科技有限公司)、40%多菌靈懸浮劑(深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司)、43%氟菌肟菌酯乳油(德國(guó)拜耳股份公司生產(chǎn))。均為市售。

1.2 方 法

1.2.1 拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定

將實(shí)驗(yàn)室保存的拮抗細(xì)菌從4℃冰箱取出，在NA培養(yǎng)基上活化24 h備用。將尖孢鐮刀菌st89從-20℃甘油取出，在PDA培養(yǎng)基上活化7 d備用。將活化后的棉花枯萎病病原菌利用打孔器(Φ：6 mm)接到PDA培養(yǎng)基的中心，并將6種拮抗細(xì)菌利用牙簽(已滅菌)涂到距離病原菌左、右1 cm處，并涂等量蒸餾水做CK，每個(gè)處理重復(fù)3次，待CK長(zhǎng)到滿皿時(shí)采用平板對(duì)峙法[14]，測(cè)量每株拮抗細(xì)菌的抑菌寬度，計(jì)算抑菌率[15]。

菌絲生長(zhǎng)抑制速率(%)=

1.2.2 室內(nèi)化學(xué)殺菌劑的毒力測(cè)定

選取7種化學(xué)藥劑利用菌絲抑制生長(zhǎng)速率法[16]測(cè)定毒力大小。將2 g化學(xué)藥劑溶解到100 mL無菌水中，配制成藥劑含量為20 g/L的母液備用。按照不同比例稀釋后，加入經(jīng)滅菌后、冷卻到60℃的PDA培養(yǎng)基中，將50%甲基硫菌靈可濕性粉劑、40%多菌靈懸浮劑、43%氟菌肟菌酯乳油、80%代森錳鋅可濕性粉劑、80%乙蒜素乳油、30%噁霉靈可濕性乳油、50%福美雙可濕性粉劑制備成6.15、12.5、25、50、100 mg/L(制劑濃度)的含藥PDA培養(yǎng)基，加入等量的蒸餾水做空白對(duì)照。利用打孔器(Φ：6 mm)將長(zhǎng)勢(shì)良好且生長(zhǎng)狀態(tài)一致的病原菌制成菌餅后，接到不同含藥濃度的PDA培養(yǎng)基中，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。待7 d后觀察菌絲生長(zhǎng)情況，測(cè)定菌絲生長(zhǎng)寬度，并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制速率，同上。表1

1.2.3 KXZ-33與化學(xué)藥劑的相容性檢測(cè)1.2.3.1 種子液制備

將活化好的KXZ-33利用接種環(huán)在無菌條件下接入裝有NA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、24 h搖床活化,再接入NA液體培養(yǎng)基中30℃、24 h制成種子液備用[17]。

1.2.3.2 相容性測(cè)定

將生防細(xì)菌KXZ-33種子液接到含有效成分含量為20、50 mg/L甲基硫菌靈、多菌靈、福美雙的改良NYBD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min、恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h后利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD600。將培養(yǎng)液梯度稀釋10-6、10-7、10-8進(jìn)行平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)，確定與KXZ-33相容性最好的化學(xué)藥劑。

1.2.4 KXZ-33與化學(xué)藥劑協(xié)同防治棉花枯萎病盆栽試驗(yàn)

將籽粒飽滿均勻的棉種用75%乙醇消毒30 s后晾干，將棉種放入活菌數(shù)為1×107cfu/mL的KXZ-33發(fā)酵液中浸種30 min，蒸餾水浸種30 min作為CK。將棉種播種到裝有營(yíng)養(yǎng)土中，花盆長(zhǎng)×寬×高為120 mm×120 mm×100 mm，每盆12粒。用待棉花長(zhǎng)至2片真葉時(shí)進(jìn)行利用傷根接菌法進(jìn)行接菌，接菌3 d后噴施化學(xué)殺菌劑。試驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)處理，每組4個(gè)重復(fù)，其中A：KXZ-33浸種；B：噴施30 mg/L的甲基硫菌靈10 mL；C: KXZ-33浸種+噴施15 mg/L甲基硫菌靈10 mL；D：噴施20 mg/L多菌靈10 mL；E：KXZ-33浸種+噴施10 mg/L的多菌靈10 mL；F：CK。分別在藥劑處理后7、14 、21 、28 d分別調(diào)查棉花的病情指數(shù)，并計(jì)算防病效果。苗期棉花病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照石磊巖5級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查[18]。

防治效果(%)=

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差分析(P<0.05)，Duncan法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn),GraphPad Prism 7.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花根基細(xì)菌對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率

研究表明，3株對(duì)棉花枯萎病病原菌的抑制率達(dá)到70.00%以上，其中KXZ-33菌株對(duì)尖刀鐮孢菌的抑菌率最高為79.53%,Hwt34的抑菌率最低為56.69%。UB17-1對(duì)棉花枯萎病的抑菌率可達(dá)到75.51%，Twt34的抑菌率為71.65%。KXZ-33、UB17-1和Twt343種生防細(xì)菌對(duì)棉花枯萎病的防治均有較大的生防潛力。表1

表 1 棉花根基細(xì)菌對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率Table 1 The inhibition rate of bacteria from cotton roots against F.oxysporum

2.2 室內(nèi)化學(xué)殺菌劑的毒力測(cè)定

研究表明，50%甲基硫菌靈可濕性粉劑、40%多菌靈懸浮劑、43%氟菌肟菌酯乳油、80%代森錳鋅可濕性粉劑、80%乙蒜素乳油、80%噁霉靈乳油、50%福美雙可濕性粉劑的EC50分別為15.840 1、18.018 0、188.827 7、1 987.788 6、125.748 0、89.221 3、12.794 0 mg/L。其中50%福美雙可濕性粉劑對(duì)病原菌的毒力最高，50%甲基硫菌靈可濕性粉劑、40%多菌靈懸浮劑次之，且三者EC50值都小于20 mg/L。40%多菌靈懸浮劑的靈敏度最高。毒力較差的分為是80%乙蒜素乳油、80%代森錳鋅可濕性粉劑，其中80%代森錳鋅可濕性粉劑最差為1 987.788 6 mg/L。表2

表 2 化學(xué)殺菌劑對(duì)尖刀鐮孢菌的室內(nèi)毒力測(cè)定Table 2 Laboratory toxicity test of chemical pesticides to F.oxysporum

2.3 KXZ-33與化學(xué)藥劑的相容性

研究表明，在含20 mg/L KXZ-33在含有不同濃度的化學(xué)殺菌劑NYBD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，CK活菌數(shù)為2.41×107cfu/mL，含有20 mg/L的甲基硫菌靈的改良NYBD液體培養(yǎng)基中的活菌數(shù)為2.18×107cfu/mL的相容性最佳，與生防細(xì)菌的相容性達(dá)到90.46%。含有50 mg/L的甲基硫菌靈改良NYBD液體培養(yǎng)基中的活菌數(shù)為1.76×107cfu/mL，KXZ-33的相容性為73.03%，與20 mg/L的甲基硫菌靈相比下降了17.43%。20 mg/L的多菌靈活菌數(shù)為1.45×107cfu/mL,與KXZ-33的相容性為60.17%。KXZ-33與福美雙的相容性最低，50 mg/L福美雙下無法正常生長(zhǎng)。圖1

圖1 KXZ-33與化學(xué)藥劑的相容性Fig.1 Compatibility analysis of KXZ-33 with chemical agents

2.4 化學(xué)殺菌劑與KXZ-33協(xié)同防控棉花枯萎病效果

研究表明，KXZ-33在與化學(xué)殺菌劑協(xié)同使用時(shí)，50%甲基硫菌靈可濕性粉劑與40%多菌靈懸浮劑在防效上表現(xiàn)出較大的差異。施藥7 d時(shí)，E:組KXZ-33浸種+10 mg/L多菌靈的防治效果最好為90.5%，A組：KXZ-33浸種的防效為72.4%，C組：KXZ-33浸種+10 mg/L甲基硫菌靈的防治效果為87.7%。施藥后14 d防治效果均有所下降，E組：KXZ-33浸種+10 mg/L多菌靈下降最為明顯，C組：KXZ-33浸種+10 mg/L甲基硫菌靈防效最高為57.7%。E防效持續(xù)下降為35.2%，且與D組防效相當(dāng)。施藥后21 d，C組：KXZ-33浸種+10 mg/L甲基硫菌靈的防效最高為56.3%，優(yōu)于單獨(dú)使用化學(xué)藥劑、KXZ-33浸種的試驗(yàn)組。施藥28 d時(shí)C組的防效最高為43.7%，相較于其他試驗(yàn)組穩(wěn)定性最強(qiáng)，E組防治效果為27.0%。KXZ-33與化學(xué)殺菌劑進(jìn)行協(xié)同防治的過程中雖然整體防效表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，但10 mg/L甲基硫菌靈與生防菌KXZ-33的協(xié)同防治效果優(yōu)于10 mg/L多菌靈與生防菌KXZ-33的防治效果。在28 d時(shí)棉花枯萎病的防病效果KXZ-33浸種+10 mg/L甲基硫菌靈>20 mg/L甲基硫菌靈>KXZ-33浸種+10 mg/L多菌靈>KXZ-33浸種>20 mg/L多菌靈。表4

表4 不同化學(xué)殺菌劑與KXZ-33協(xié)同防控棉花枯萎病的防病效果Table 4 Synergistic control effect of different chemical fungicides and KXZ-33 on Fusarium wilt of cotton

3 討 論

劉郵洲等[19]通過利用1×1010cfu/mL可濕性枯草芽孢桿菌與17%咪鮮胺錳鹽進(jìn)行協(xié)同防治番茄枯萎病在田間70 d的防效可以達(dá)到79.5%，實(shí)現(xiàn)對(duì)番茄枯萎病的有效防治。棉花初期使用拮抗菌KXZ-33浸種后的實(shí)驗(yàn)組的棉花枯萎病的防效較未使用KXZ-33的實(shí)驗(yàn)組防病效果高，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)KXZ-33在土壤的復(fù)雜環(huán)境中的生防細(xì)菌的防效從72.4%逐漸降低到20.2%。

崔凱等[20]探究甲基硫菌靈與其主要代謝產(chǎn)物多菌靈對(duì)棉花枯萎病的根基細(xì)菌多樣性與相對(duì)豐富度表明，高劑量的化學(xué)農(nóng)藥會(huì)降低根際土壤細(xì)菌多樣性與相對(duì)豐富度的降低。KXZ-33與甲基硫菌靈具有很好的相融性，并通過種子處理與噴施相結(jié)合方式在室內(nèi)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，而種子包衣是一項(xiàng)先進(jìn)的輕簡(jiǎn)化種子處理技術(shù)，具有高效、低毒、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，也是農(nóng)藥減施、綠色生產(chǎn)的有效措施。

4 結(jié) 論

7種化學(xué)殺菌劑對(duì)病原菌的生長(zhǎng)有不同程度影響顯示。50%福美雙可濕性粉劑對(duì)尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)的毒力最強(qiáng)，50%甲基硫菌靈可濕性粉劑、40%多菌靈懸浮劑次之，80%代森錳鋅可濕性粉劑的毒力最差。20 mg/L甲基硫菌靈的OD600與CK差距最小，且較高濃度50 mg/L的甲基硫菌靈也對(duì)生防細(xì)菌有較高的相容性，20 mg/L多菌靈次之。無論是低濃度20 mg/L福美雙，還是高濃度50 mg/L的福美雙與生防細(xì)菌KXZ-33的相容性都較差。

甲基硫菌靈與KXZ-33的聯(lián)合使用中可以有效的提高棉花枯萎病的防治效果，在生防細(xì)菌隨時(shí)間推移的防治效果下降的情況下，合理的使用化學(xué)殺菌劑可以達(dá)到提高的防效作用。