超聲串聯(lián)固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定加熱米制品中丙烯酰胺

殷 斌

(南京理工大學(xué)泰州科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

丙烯酰胺是一種神經(jīng)毒素，威脅食品安全并對(duì)人類健康的產(chǎn)生嚴(yán)重危害，可導(dǎo)致細(xì)胞遺傳物質(zhì)DNA的損傷[1-2]，高劑量的丙烯酰胺會(huì)影響人類的神經(jīng)系統(tǒng)[3]、生殖系統(tǒng)[4]并具有一定的致癌性[5]。食品加熱(包括油炸、烘焙、烹飪、蒸煮)過(guò)程往往產(chǎn)生丙烯酰胺，尤其是高溫處理的食品中廣泛存在較高水平的丙烯酰胺[6-7]，因而加熱食品中丙烯酰胺的分析對(duì)食品質(zhì)量管理，保障食品安全具有重要的實(shí)際意義。米制品是我國(guó)居民日常生活的主要食物之一，但目前的研究集中于薯?xiàng)l、面包、咖啡等加熱食品，對(duì)米制品的研究較少。

目前，加熱食品中丙烯酰胺含量的檢測(cè)方法主要集中于GC-MS和LC-MS(包括LC-MS-MS)[8-11]，GC-MS和LC-MS測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確、檢測(cè)限較低、分析方法應(yīng)用較廣泛[12-14]，但儀器昂貴，往往需要衍生處理和加入同位素內(nèi)標(biāo)。高效液相色譜精密度相對(duì)較高并且進(jìn)樣量小，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，并且國(guó)內(nèi)外都已經(jīng)有人使用液相色譜檢測(cè)出了食品中的丙烯酰胺，操作較為成熟。在樣品分析過(guò)程中，良好的樣品前處理方法不僅可以提高檢測(cè)的靈敏度、縮短檢測(cè)時(shí)間、提高檢測(cè)效率，還可以大幅去除雜質(zhì)，降低基體水平。超聲提取與傳統(tǒng)的震蕩等提取方式相比具有不需要高溫、較為安全，簡(jiǎn)單便于操作、萃取效果好、具有一定的廣譜性，適用性廣、對(duì)溶劑和分析物的性質(zhì)要求小、成本較低、節(jié)約能源和時(shí)間。而目運(yùn)用超聲串聯(lián)固相萃取對(duì)米制品進(jìn)行樣品前處理進(jìn)而測(cè)定丙烯酰胺的研究很少。本文針對(duì)丙烯酰胺現(xiàn)有分析方法中存在的分析時(shí)間長(zhǎng)，需要加入內(nèi)標(biāo)等不足，通過(guò)超聲串聯(lián)固相萃取對(duì)樣品中的丙烯酰胺進(jìn)行提取和凈化，建立高效液相色譜檢測(cè)丙烯酰胺的新方法并將其應(yīng)用于米類加熱食品的分析檢測(cè)，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1100高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)系統(tǒng)，美國(guó)安捷倫公司；KQ-100E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器公司；固相萃取抽氣系統(tǒng)，美國(guó)SUPELCO公司；DC12H 型氮吹儀，上海安普科學(xué)儀器公司；SK-1快速混勻儀、KX-29離心沉淀機(jī)，金壇市科析儀器有限公司；Master-S純水機(jī)，上海和泰儀器有限公司；AL204電子分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；0.22 μm和0.45 μm微孔濾膜，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

超純級(jí)丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(>99%)，阿拉丁公司；甲醇、乙腈(色譜純)，上海安普科學(xué)儀器公司；丙酮、正己烷、乙酸乙酯(分析純)，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；HC-C18填料、中性氧化鋁(分析純)，450 ℃灼燒4 h；弗羅里硅土(分析純)，德國(guó)CNW科技公司；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱量0.020 g丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，將其倒入25 mL容量瓶中，用少量超純水將稱量紙上殘留的標(biāo)準(zhǔn)品全部沖入瓶中，加入超純水定容至刻度線，配成200 mg/kg(200 mg/L)的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。

各濃度丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)使用液由儲(chǔ)備液加水稀釋而成并經(jīng)過(guò)0.22 μm尼龍濾膜。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

本次實(shí)驗(yàn)所有樣品(旺旺米雪餅、米老頭炒米卷、鍋巴、米線、大米、長(zhǎng)鼻王米卷)都是從學(xué)校周圍的超市中購(gòu)得，先將所有樣品分別粉碎，然后將初步粉碎后的樣品磨成粉末，加入到100 mL離心管中，后加入20 mL正己烷震蕩混勻10 min后放入臺(tái)式低速離心機(jī)，離心15 min后取出，棄去上層清夜，再加入15 mL相同溶劑重復(fù)震蕩離心操作，后將剩余的半固態(tài)樣品取出，放入燒杯中封上封口膜后放入鼓風(fēng)干燥箱烘干一晚，設(shè)定溫度40 ℃，備用。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.500 g樣品于尖底離心管中，后加入提取劑乙酸乙酯和甲醇(6:4)3 mL,在快速混勻儀上混勻2 min,混合均勻后在室溫下超聲提取15 min(功率180 W)，取出后，放入離心機(jī)中離心5 min后倒出上層清夜，再重復(fù)以上步驟操作兩次，將三次提取液合并待凈化。若是加標(biāo)樣品需要在加提取劑之前加入一定量的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品再進(jìn)行后期操作。

將HC-C18吸附小柱插入抽氣泵系統(tǒng)，先使用3 mL甲醇活化干的HC-C18小柱，舍棄活化后的濾液，再將經(jīng)過(guò)超聲提取的清液，加入小柱中，打開抽氣泵，控制流速約為1 mL/min，收集預(yù)淋液，當(dāng)預(yù)淋結(jié)束后，再分別加入3 mL的甲醇進(jìn)行洗脫三次，收集洗脫液。

結(jié)束固相萃取操作后控制氮吹儀氮吹速度0.4 L/min并將洗脫液和預(yù)淋液氮吹至近干，再用超純水定容至1 mL,再加入2 mL正己烷，在混勻儀上混勻3 min，靜置分層后，放入低速離心機(jī)中離心5 min，轉(zhuǎn)速3000 r/min。

用細(xì)針筒將離心后的下層液體取出，再通過(guò)0.22 μm的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，再用微量進(jìn)樣針取樣10 μL進(jìn)入高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 色譜條件

最優(yōu)色譜條件為：紫外吸收波長(zhǎng)210 nm，流動(dòng)相為70%甲醇和30%水(V:V)，流速為0.7 mL/min，檢測(cè)溫度設(shè)定為30 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 提取劑種類的選擇

混合溶劑的種類不同作為提取劑的提取效果差別很大，所以選定混合劑的種類十分重要，先通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)甲醇，乙酸乙酯，乙腈，丙酮，二氯甲烷五種提取劑進(jìn)行對(duì)比，其中用乙酸乙酯提取的樣品，丙烯酰胺峰和雜質(zhì)峰的分離效果比較好，且提取效果最好。所以我在這里選取乙酸乙酯和甲醇的混合溶液，乙酸乙酯和丙酮的混合溶液，乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶液這三種混合溶液作為提取劑，每種混合溶液的體積比都是1:1。提取效果如下圖1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑的提取效果最好。

2.1.2 混合溶劑的比例確定

混合溶劑各組分的比例會(huì)影響混合溶劑的極性，根據(jù)2.1確定的比例關(guān)系，在此次實(shí)驗(yàn)中使用乙酸乙酯甲醇比例分別為8:2、7:3、6:4、5:5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。如圖所示在體積比為6:4時(shí)，丙烯酰胺的提取效果最好。

2.1.3 超聲萃取次數(shù)的優(yōu)化

萃取次數(shù)的不一樣會(huì)直接影響萃取的效率，所以確定超聲次數(shù)也是一個(gè)十分重要的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。取相同的三份樣品分別萃取1、2、3次，比較不同次數(shù)提取效果的不同，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知萃取三次與萃取一次的結(jié)果相比較，萃取了三次的結(jié)果相對(duì)比一次的提高了42.9%，所以以此可以充分得知萃取三次的對(duì)丙烯酰胺從樣品中被提取出來(lái)的效率遠(yuǎn)比只萃取一次的要高的多，并且考慮到對(duì)前處理時(shí)間的控制所以采用萃取次數(shù)為3次。

2.1.4 單次萃取時(shí)間的優(yōu)化

對(duì)于同一種萃取劑來(lái)說(shuō)影響萃取效率的因素除了萃取的次數(shù)，還有萃取的時(shí)間也會(huì)對(duì)萃取結(jié)果造成影響。分別以5、10、15、20、25 min作為單次萃取的時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)萃取效率的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，單次超聲時(shí)間15 min時(shí)丙烯酰胺的提取量最大，超過(guò)15 min后丙烯酰胺的提取量略微減少，猜測(cè)是丙烯酰胺在超聲環(huán)境下時(shí)間過(guò)長(zhǎng)產(chǎn)生了聚合效應(yīng)，導(dǎo)致丙烯酰胺的含量減小。

2.1.5 洗脫劑的優(yōu)化

在固相萃取法中，洗脫劑也是一個(gè)十分重要的實(shí)驗(yàn)操作步驟，結(jié)合丙烯酰胺的極性和2.1.1中提取劑的優(yōu)化結(jié)果我決定分別使用甲醇，乙酸乙酯，甲醇和乙酸乙酯的混合溶液(V:V=5:1)，乙腈各6 mL來(lái)進(jìn)行洗脫。其結(jié)果如表1所示。

表1 洗脫劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

由表1結(jié)果可以看出除乙腈洗脫效果略差于其他三種洗脫劑外，其他幾種溶劑的洗脫效果相差不大，根據(jù)最后結(jié)果可以看出甲醇和乙酸乙酯的混合溶液的洗脫效果要略優(yōu)于其他兩種洗脫劑，所以最后選定的洗脫劑為甲醇和乙酸乙酯的混合溶液其體積比為5:1。

2.2 高效液相色譜條件

2.2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

HPLC的流動(dòng)相是影響出峰峰形和出峰時(shí)間的重要因素。為選擇合適的流動(dòng)相配比，如表2所示。在進(jìn)同一10 mg/kg的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品后，本文對(duì)比了幾種不同流動(dòng)相所出的峰型，峰面積之后確定使用70%甲醇+30%水這一流動(dòng)相，其會(huì)比較適合丙烯酰胺出峰。

表2 不同流動(dòng)相出峰對(duì)比

2.2.2 流速的優(yōu)化

本文考察了流速分別是0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 mL/min時(shí)20 mg/kg的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品所出峰的峰寬、峰面積、N值的大小,如表3所示。

表3 流速對(duì)出峰各要素的影響

在對(duì)丙烯酰胺出峰時(shí)我們需要適當(dāng)降低峰寬，提升峰高，并且適當(dāng)增大峰面積，而從圖表中可以看出在不同的流速下，出峰時(shí)間隨著流速的增加而提前，各個(gè)峰的峰高基本沒有太大的變化，在峰高一定時(shí)流速0.7 mL/min時(shí)峰寬和峰面積與其他情況相比更加適中。所以確定流速為0.7 mL/min時(shí)為最適合的流速。下圖是在此流速下測(cè)得的20 mg/L丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)圖，見圖4。

圖4 流動(dòng)相70%甲醇+30%水，流速0.7 mL/min時(shí)丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制0.25、0.5、2、5、10、20、40 mg/L的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，每種濃度進(jìn)樣5次取平均值后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。丙烯酰胺質(zhì)量濃度在0.25～40 mg/L時(shí)，對(duì)丙烯酰胺峰面積y和濃度x(mg/L) 進(jìn)行線性擬合。結(jié)果表明，在0.25～40 mg/L范圍內(nèi)，丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=89.279x+50.297，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9996。方法的檢出限(S/N=3)為0.0874 mg/L(表 4) 。

表4 丙烯酰胺的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

在確定最優(yōu)方法之后，使用最優(yōu)條件的最優(yōu)預(yù)處理方法測(cè)定六種實(shí)際米制品中的丙烯酰胺含量。6種米制品都購(gòu)買于學(xué)校周邊與我們大學(xué)生的生活息息相關(guān)，6種米制品中丙烯酰胺含量蒸大米未檢出、過(guò)橋米線0.316 mg/kg、米鍋巴0.434 mg/kg、旺旺米雪餅6.234 mg/kg、長(zhǎng)鼻王米卷1.754 mg/kg、包糖炒米4.496 mg/kg，樣品中丙烯酰胺的回收率為95.2%～100.2%之間，RSD值在6.9%～8.2%。

其中雪餅，米卷，包糖炒米三種樣品含量較高，原因可能是工業(yè)制作過(guò)程中的操作步驟較復(fù)雜，加熱溫度過(guò)高所造成，而雪餅含量高達(dá)6 mg/kg左右，除了可能制作過(guò)程較為復(fù)雜外，參考其配料表發(fā)現(xiàn)其大米含量越60%，還有近40%為薯類，而根據(jù)國(guó)際機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果顯示薯類制品中的丙烯酰胺含量遠(yuǎn)高于其他食品。

3 結(jié) 論

超聲串聯(lián)固相萃取作為前處理方法能夠有效地提取米制品中的丙烯酰胺并且具有良好的凈化作用。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、凈化效果好、回收率高，適用于米制品中痕量丙烯酰胺的測(cè)定。