水產(chǎn)品中N-亞硝胺形成和控制的研究進(jìn)展

楊?yuàn)檴櫍跽诅鯐增Y萬(wàn)楓，張鳳艷

青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院（青島 266073）

N-亞硝胺（N-nitrosamine，NAs）是世界上公認(rèn)的致癌物之一，具有致癌性、致畸性及致突變性，會(huì)對(duì)人體造成極大傷害，廣泛存在于食品、酒精飲料及飲用水中。肉制品和水產(chǎn)品富含蛋白質(zhì)，極易受到微生物污染，發(fā)生降解，生成胺類物質(zhì)，與氮氧化合物結(jié)合生成NAs，所以加工肉制品、水產(chǎn)品等食品中存在較高含量的亞硝胺。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)肉制品中NAs研究較多，對(duì)水產(chǎn)品中NAs研究相對(duì)較少。水產(chǎn)品富含大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，消費(fèi)量逐年升高，應(yīng)重視水產(chǎn)品中NAs含量。因此，對(duì)NAs進(jìn)行概述，介紹水產(chǎn)品中NAs生成機(jī)理，并總結(jié)影響水產(chǎn)品中NAs生成的因素及控制技術(shù)，以期為降低我國(guó)水產(chǎn)品中NAs含量、提高水產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性提供參考。

1 亞硝胺概述

1.1 致癌性

NAs是世界公認(rèn)的三大強(qiáng)烈致癌物之一，具有遺傳毒性，可導(dǎo)致DNA損傷，引起堿基突變，誘發(fā)癌癥。大量試驗(yàn)證明，攝入NAs會(huì)增加罹患胃癌、食管癌、鼻咽癌和膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)[1]。1987年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將NDMA和NDEA列為2A致癌物；將N-甲基乙基亞硝胺（N-Methylethylnitrosamine，NMEA）、N-亞硝基吡咯烷（N-Nitrosopyrolidine，NPYR）、N-亞硝基哌啶（N-Nitrosopiperidine，NPIP）等列為2B致癌物。長(zhǎng)期少量攝入或一次攝入大量NAs均會(huì)誘發(fā)腫瘤。

NAs是間接致癌物，其致癌機(jī)理主要有：（1）氧化脫氨，使DNA堿基中的氨基氧化；（2）細(xì)胞色素CYP2E1酶系統(tǒng)催化NAs羥化和裂解，形成重氮離子，促使核酸烷基化；（3）細(xì)胞色素P450酶激活作用，形成烷基化的DNA堿基[2-3]；（4）塑造炎癥微環(huán)境，激活氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)信號(hào)通路，造成DNA損傷，引起癌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[4]。

1.2 毒性

一次或多次攝入含過(guò)量NAs的食物會(huì)引發(fā)NAs急性中毒，主要表現(xiàn)為肝臟損傷及血小板破壞，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致全身中毒。以NDMA動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)為例，大鼠半數(shù)致死量（LD50）為24～40 mg/kg。據(jù)有關(guān)資料推測(cè)，如果兒童一次攝入量達(dá)到300 mg，成人一次攝入量達(dá)到1 200 mg就會(huì)導(dǎo)致死亡。有報(bào)道人體對(duì)揮發(fā)性NAs耐受水平在5～10 μg/kg[5]。NAs會(huì)導(dǎo)致以肝硬化為主的慢性中毒，主要發(fā)生在經(jīng)常食用含NAs食品（腌肉、咸魚、腌菜等）的人群中[6]。

2 NAs的形成過(guò)程以及影響因素

2.1 NAs的形成機(jī)理

NAs是由胺類物質(zhì)與亞硝基化合物發(fā)生親電反應(yīng)形成的。胺類物質(zhì)主要是指伯胺、仲胺、叔胺、羥胺及胺過(guò)氧化物等；亞硝化試劑包括N2O3、N2O4及亞硝酸根離子（NO+·H2O）等[7]。

大部分學(xué)者認(rèn)為食品中NAs生成途徑：酸性條件下，亞硝酸鹽與H+發(fā)生反應(yīng)生成亞硝酸，亞硝酸不穩(wěn)定分解產(chǎn)生N2O3，N2O3與胺類物質(zhì)發(fā)生亞硝化反應(yīng)，生成NAs，見(jiàn)圖1。

圖1 NAs反應(yīng)生成圖

仲胺與亞硝化試劑可形成穩(wěn)定的NAs，伯胺與亞硝化試劑發(fā)生反應(yīng)，生成重氮中間體，會(huì)立即分解為醇和氮[8]。叔胺也可通過(guò)脫烷基亞硝化反應(yīng)生成NAs，但速率要比仲胺慢得多。在醛，特別是甲醛存在下，亞硝化反應(yīng)被催化，甚至可以在中性或堿性條件下進(jìn)行[9]。

2.2 影響因素

水產(chǎn)品中NAs含量受多種因素影響，主要包括pH、溫度、前體物質(zhì)濃度、添加劑、加工處理方式及微生物作用等。

2.2.1 pH

pH是影響NAs形成的重要因素。在酸性條件下，亞硝酸鹽與H+結(jié)合形成亞硝酸，亞硝酸轉(zhuǎn)化為氮氧化合物，才能與胺類物質(zhì)反應(yīng)形成亞硝胺。因此，若H+含量過(guò)低，亞硝酸鹽就難以形成亞硝酸，從而降低NAs生成量。但如果H+含量過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致胺類化合物質(zhì)子化，不能與氮氧化合物發(fā)生反應(yīng)；同時(shí)pH較低，影響硝酸鹽還原菌的活性，不能有效催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，影響NAs的生成。一般認(rèn)為，亞硝化反應(yīng)最佳pH為3～4[10]。

2.2.2 溫度

溫度對(duì)NAs生成的影響很大。熱處理是常用的水產(chǎn)品加工方式。溫度每升高10 ℃，化學(xué)反應(yīng)速率會(huì)增加1倍[1]。楊華等[11]采用體外模擬體系研究溫度對(duì)NAs形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NDMA與NDEA的生成量隨溫度升高而增加。將脯氨酸與亞硝酸鈉置于反應(yīng)體系中，溫度在4～80 ℃時(shí)，增大底物濃度，未生成NAs，在低底物濃度，溫度121 ℃時(shí)，檢測(cè)到NPYR。當(dāng)?shù)孜锎嬖跁r(shí)，高溫是形成NPYR的必要條件。Drabik-markiewicz等[12]研究發(fā)現(xiàn)較高的加工溫度會(huì)促進(jìn)NDMA和NPYP的形成。升高溫度不僅提高反應(yīng)體系速率，也會(huì)加快蛋白質(zhì)分解，增加胺類物質(zhì)濃度，促進(jìn)NAs生成。

2.2.3 組織成分

蛋白質(zhì)發(fā)生腐敗變質(zhì)，會(huì)產(chǎn)生豐富的胺類物質(zhì)，生物胺（微生物產(chǎn)生的脫羧酶促使氨基酸脫羧形成的一類小分子化合物）含量大幅增加，為NAs提供前體物質(zhì)[13]。Drabik-markiewicz等[14]發(fā)現(xiàn)亞精胺對(duì)NDMA的形成有明顯促進(jìn)作用，亞精胺是NDMA的前體物質(zhì)。

脂肪含量影響NAs的生成，新生成的NAs主要集中于脂肪。熊鳳嬌[15]研究脂肪對(duì)魚糜制品NAs的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在魚糜制品加工過(guò)程中添加脂肪可增加NMEA和NDEA含量，NAs含量與脂肪含量呈正相關(guān)，脂肪種類和比例會(huì)影響NAs含量。在加熱過(guò)程中，脂肪溫度較高，為NAs生成提供良好環(huán)境條件，另外脂肪在加熱時(shí)氧化產(chǎn)生丙二醛及游離脂肪酸，釋放自由基促進(jìn)NAs生成[16]。

2.2.4 微生物

微生物對(duì)NAs生成起到促進(jìn)作用，主要有3方面：一是腸桿菌屬和厭氧芽胞桿菌屬具有合成NAs的能力，青霉菌和根霉菌屬對(duì)NAs合成起到生物催化作用[17]；二是微生物降解蛋白質(zhì)為胺類，反硝化細(xì)菌可將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，為NAs生成提供前體物質(zhì)；三是很多微生物在自身生長(zhǎng)過(guò)程中，利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，生成H+，為NAs合成提供穩(wěn)定酸性條件，如乳酸菌。

2.2.5 加工輔料

在水產(chǎn)品加工過(guò)程中，影響NAs形成常用添加劑主要包括硝酸鹽和亞硝酸鹽、NaCl、多聚磷酸鈉、VC、VE及天然抗氧化物。硝酸鹽和亞硝酸鹽在水產(chǎn)品加工中的作用主要有形成獨(dú)特風(fēng)味、保持水產(chǎn)品鮮亮的顏色、抗氧化、抑制微生物生長(zhǎng)、螯合和穩(wěn)定制品。但NAs含量與亞硝酸鹽含量呈正比。

在水產(chǎn)品加工中，添加NaCl可有效抑制微生物生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)水產(chǎn)品貨架期。NaCl對(duì)亞硝胺的形成起抑制作用。Rywotycki[18]研究發(fā)現(xiàn)，添加2% NaCl要比未添加NaCl的肉中NAs含量低。NaCl與VC起到協(xié)同作用，添加2% NaCl和0.03% VC要比分別單獨(dú)添加降低NDMA和NDEA的效果好。NaCl通過(guò)改變離子環(huán)境降低NAs含量。多聚磷酸鹽可增加肉的持水能力，穩(wěn)定乳狀液，脂相和水相乳化時(shí)，促進(jìn)亞硝基化合物和胺類物質(zhì)交換，促使NAs生成[1]。

研究發(fā)現(xiàn)VC、VE、山梨酸、單寧酸、沒(méi)食子丙酸、植物多酚等能夠有效地抑制NAs形成[19]。VC是水溶性還原劑，VE是脂溶性還原劑，可將HNO2還原成NO，有效減少NAs前體物質(zhì)，阻斷NAs的生成[17]。

在水產(chǎn)品加工過(guò)程中添加一些香料物質(zhì)，如黑胡椒、辣椒粉等。黑胡椒中含有哌啶和N-硝基哌啶，添加黑胡椒會(huì)導(dǎo)致NPIP的生成[20]。

2.2.6 加工處理方式

Yurchenko等[21]對(duì)肉制品進(jìn)行不同加工處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)油炸肉中NAs含量最高，其次是烤肉、熏肉，再次是半熏香腸和火腿，而生肉中未發(fā)現(xiàn)有NAs。Li等[22]也發(fā)現(xiàn)油炸處理會(huì)導(dǎo)致NAs含量增加。加工處理方式對(duì)NAs產(chǎn)生影響原因在于：不同加工處理方式達(dá)到的溫度不同，油炸溫度顯著高于蒸煮、微波加熱溫度；熏制方式會(huì)產(chǎn)生更多的氮氧化合物，為亞硝化反應(yīng)提供亞硝化試劑；腌制魚要比干制魚中NAs含量高，腌制時(shí)間、溫度及腌制過(guò)程中的微生物會(huì)影響NAs的生成[23]。

3 控制NAs形成的方法

NAs是影響水產(chǎn)品安全的風(fēng)險(xiǎn)因子，形成后難以降解[24]，需有效控制。可從控制NAs前體物質(zhì)含量、阻斷NAs合成、增加NAs降解3個(gè)方面入手。

3.1 減少NAs前體物質(zhì)含量

NAs是由亞硝酸鹽與胺類物質(zhì)通過(guò)多級(jí)反應(yīng)生成的。可通過(guò)控制亞硝酸鹽使用量及減少胺類物質(zhì)產(chǎn)生2個(gè)方面入手。

3.1.1 控制亞硝酸鹽含量

亞硝酸鹽是劇毒物質(zhì)，中毒量為0.2～0.5 g，致死量為3 g。攝入較多亞硝酸鹽會(huì)引起機(jī)體缺氧，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡；亞硝酸鹽是致癌性NAs的前體物質(zhì)，所以國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者都在研究亞硝酸鹽替代物及降解亞硝酸鹽的方法。主要方法有：（1）化學(xué)物質(zhì)替代亞硝酸鹽。芹菜汁、番茄紅素、干紅葡萄渣、天然香料提取物、亞硝基化血紅蛋白、山梨酸鉀和紅曲色素等用于替代亞硝酸鹽的功能或部分功能[25-29]。王衛(wèi)等[25]采用商業(yè)化天然植物提取物T10（脫水醋粉、麥芽糊精的等量混合物）和DV（白檸檬、甜橙、迷迭香、葡萄柚、石榴提取物的等量混合物）代替亞硝酸鹽，用于風(fēng)干魚腌制，結(jié)果表明添加T10和DV魚中亞硝酸鹽殘留量遠(yuǎn)低于添加亞硝酸鹽組，添加T10呈現(xiàn)出的色澤與添加亞硝酸鹽組無(wú)差異，2種植物提取物抑菌效果弱于亞硝酸鹽。（2）微生物發(fā)酵替代亞硝酸鹽或降解亞硝酸鹽。一些乳酸菌、葡萄球菌以及片球菌可將高鐵肌紅蛋白轉(zhuǎn)化為肌紅蛋白衍生物，起發(fā)色作用[30]。劉玉等[31]從腌制藍(lán)圓鲹干中分離出羅伊乳桿菌，將其應(yīng)用于降解金線魚魚糜亞硝酸鹽，降解率達(dá)65.33%。（3）采用超聲波、超高壓等物理方法降解亞硝酸鹽。張麗華等[32]優(yōu)化超聲波處理咸海鯰魚條件，超聲波功率200 W、時(shí)間24 min，咸魚質(zhì)量12 g，對(duì)亞硝酸鹽的消除率為99.4%。艾穎超等[33]采用高壓處理真空包裝的鱸魚，亞硝酸鹽含量有所增加，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，殘留的亞硝酸鹽含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。物理方法對(duì)降解亞硝酸鹽作用有限，還會(huì)破壞樣品組織結(jié)構(gòu)完整性。

然而大部分亞硝酸鹽替代物只能代替亞硝酸鹽部分功能，不能完全替代其所有功能，且因替代物穩(wěn)定性、分散性、成本等多方面原因，各種替代物在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用很少。

3.1.2 減少胺類物質(zhì)的產(chǎn)生

水產(chǎn)品富含蛋白質(zhì)和胺類物質(zhì)，腐敗變質(zhì)更易產(chǎn)生胺類物質(zhì)，所以可控制微生物以抑制NAs生成。水產(chǎn)品可通過(guò)低溫貯藏、氣調(diào)包裝、輻照降解、高壓處理、使用食品添加劑等抑制或減少生物胺的產(chǎn)生，還可通過(guò)接種微生物（木糖葡萄球菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌等）降解生物胺[34]，但還需大量研究才能應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

3.2 阻斷NAs的合成

通過(guò)阻止亞硝酸鹽和胺類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)以阻斷NAs的合成是控制NAs含量的重要方法，主要機(jī)理是通過(guò)添加一些還原性物質(zhì)避免或減少亞硝基化合物發(fā)生氧化。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此進(jìn)行大量研究，多種果蔬和香辛料的提取物均可以阻斷NAs的合成，主要原因是這些提取物中富含VC、VE、黃酮、多酚、還原糖等具有還原性的化合物。

VC不僅能夠促使亞硝酸鹽還原，阻止胺類與亞硝基結(jié)合，還可防止NO被氧化為NO2[35]。VE可捕獲自由基的活性氫，阻止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，阻斷亞硝胺的合成[36]。Pourazrang等[37]發(fā)現(xiàn)VC和VE對(duì)亞硝胺的抑制起協(xié)同作用。

林棟等[38]從貴長(zhǎng)獼猴桃提取多酚物質(zhì)，并模擬人體胃酸條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)獼猴桃提取物可有效清除亞硝酸鹽，清除率達(dá)到87.15%，進(jìn)而阻斷亞硝胺的合成，阻斷率為81.63%。Choi等[39]模擬人體消化系統(tǒng)，評(píng)估草莓、甘藍(lán)及大蒜對(duì)NDMA形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)草莓中的抗壞血酸、甘藍(lán)中的酚類物質(zhì)和大蒜中的烯丙基硫類化合物可以降低亞硝酸鹽的殘留量，抑制NDMA的形成。

3.3 NAs的降解

3.3.1 物理方式降解

輻照技術(shù)通過(guò)抑制微生物生長(zhǎng)達(dá)到食品保鮮的目的。Ahn等[40]發(fā)現(xiàn)輻照技術(shù)可有效降解發(fā)揮性NAs，且在體外條件下未發(fā)現(xiàn)NAs分解物重組。Ahn等[41]采用γ輻照技術(shù)處理發(fā)酵鳳尾魚醬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用5 kGy以上劑量時(shí)，可以顯著降低NDMA和NPYR含量，輻照強(qiáng)度越強(qiáng)，抑制率越高，貯藏4周，輻照樣品中NAs含量顯著低于對(duì)照組。雖然輻照處理可有效降低NAs含量，但高劑量輻照處理會(huì)降低水產(chǎn)品感官品質(zhì)，引起蛋白質(zhì)變性、油脂氧化等問(wèn)題[42]，且目前還不清楚輻照降解NAs機(jī)理，因此采用輻照技術(shù)降解NAs還需進(jìn)一步研究。

3.3.2 生物方式降解

利用微生物降解亞硝胺是一種可行的生物方式。目前多數(shù)研究集中于篩選降解亞硝酸鹽菌種，已知具有降解亞硝胺功能的菌種比較少。

游剛等[43]從腌制咸魚中分離出植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、戊糖片球菌、嗜酸乳桿菌和短乳桿菌，優(yōu)化比例復(fù)配，將復(fù)合菌添加至腌制咸魚中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌可有效降解NAs。Nowak等[44]研究4株益生菌（鼠李糖乳桿菌0900、鼠李糖乳桿菌0908、干酪乳桿菌0919和短桿菌0945）對(duì)NDMA影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益生菌對(duì)NDMA降低率達(dá)50%，其中短桿菌0945效果最顯著。許女等[45]從19株植物乳酸菌中篩選出L.plantarumCP3，此菌對(duì)亞硝酸鹽和生物胺的降解率達(dá)到95%和77%，顯著抑制NAs生成，與L.sakiM4聯(lián)合接種，發(fā)酵48 h，對(duì)NDMA的降解率達(dá)75.8%。

已篩選出一些分別具有降解亞硝酸鹽、生物胺和NAs能力的菌種，但既可降解NAs，又能降解亞硝酸鹽和生物胺的菌種還比較少，所以還需要加大篩選力度，找到同時(shí)降解3種物質(zhì)的菌種，研究發(fā)揮作用的具體酶類，制成固定化酶，應(yīng)用于生產(chǎn)中，可有效減少NAs含量，提高食品的安全性。

除此之外，還可以通過(guò)采用新鮮的原材料、改變加工方式等方法減少NAs生成。

4 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，水產(chǎn)品消費(fèi)量逐年攀升，其安全性受到廣泛關(guān)注。NAs是毒性很大的致癌物，在水產(chǎn)品貯藏、加工處理過(guò)程中很容易產(chǎn)生，嚴(yán)重危害消費(fèi)者身體健康。

國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)NAs進(jìn)行大量研究，主要集中于肉制品加工處理過(guò)程，針對(duì)水產(chǎn)品中NAs形成機(jī)理、影響因素及控制方法的研究還比較少，不能系統(tǒng)揭示水產(chǎn)品中NAs的形成變化降解規(guī)律，需要加大研究力度。

本文對(duì)NAs形成機(jī)理進(jìn)行闡述，并就影響水產(chǎn)品中NAs形成的因素進(jìn)行總結(jié)，證明水產(chǎn)品中難以避免存在大量NAs，因此，建議加大對(duì)水產(chǎn)品中NAs控制的研究。減少NAs前體物質(zhì)方面，尋找可完全替代亞硝酸鹽物質(zhì)是研究熱點(diǎn)，利用蔬菜所含的硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}，是新穎、安全性較高的研究方向；采用新鮮水產(chǎn)品進(jìn)行加工處理以減少胺類物質(zhì)的產(chǎn)生。阻斷NAs形成方面，篩選可阻斷NAs生成且適合水產(chǎn)品使用的高效物質(zhì)。降解NAs方面，需進(jìn)一步研究輻照處理降解NAs的機(jī)理；采用微生物發(fā)酵技術(shù)降解NAs是今后研究重點(diǎn)方向，篩選同時(shí)具備降解NAs、亞硝酸鹽和生物胺能力的菌種，并確定發(fā)揮作用的酶，采用固定化技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。此外，還可以綜合使用物理、化學(xué)及生物防控技術(shù)以減少水產(chǎn)品NAs含量，提高水產(chǎn)品安全性。