微波輔助法提取竹葉花椒黃酮的結構特征

何鑫柱，李潮俊，陳凱，康明，梁曉峰*

1. 西南科技大學材料科學與工程學院（綿陽 621010）；2. 四川中醫藥高等專科學校川西北中藥材資源研究與開發利用實驗室（綿陽 621010）

竹葉花椒（Zanthoxylum armatumDC.）為蕓香科花椒屬植物，主要分布在中國西南、華中、華北和華東等地區，其根、莖、葉、果實、種子均可入藥，主治胃腑冷痛，風濕關節等[1]。竹葉花椒中含有揮發油、黃酮、木質素、生物堿等活性成分[2]，具有抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂、抗衰老等藥理功效[3-5]。其中的黃酮類物質是天然多酚類化合物，具有多種生物活性。黃酮類化合物的結構中，2個苯環通過1個C3部分聯結形成C6—C3—C6骨架，由于聯結方式、連接位置、氧化水平及聚合程度等不同，使得黃酮類化合物分子結構豐富多樣，理化性質及生物活性表現各不相同[6-7]。利用現代分析測試技術對黃酮類物質結構和性能進行表征研究是黃酮研究和開發利用的重要內容，隨著現代分離技術和結構測定手段發展，許多新的黃酮類化合物得以發現[8]。近年來，對竹葉花椒的活性成分提取及其藥用性能等開展較多研究[9-10]，對竹葉花椒中總黃酮的提取、分離研究取得積極進展。利用微波輔助提取法獲得提取黃酮類物質的工藝參數。

對微波輔助法提取竹葉花椒總黃酮進一步研究分析，用聚酰胺-大孔吸附樹脂聯用的方法純化竹葉花椒中的總黃酮，利用現代分析測試技術研究竹葉花椒黃酮的譜學特征、顯微形貌、熱穩定性等特征，對豐富黃酮類物質結構和性能數據及竹葉花椒綜合開發利用具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥的竹葉花椒果皮（成都蜀荊味商貿有限公司）；95%乙醇、石油醚（分析純，成都市科隆化學品有限公司）；聚酰胺（0.250～0.600 mm，即30～60目）、D101大孔吸附樹脂（上海麥克林生化科技）。

1.2 儀器與設備

Sartorius BSA124S分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；RE52CS-2旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；YTLG-12A冷凍干燥機（上海葉拓科技有限公司）；XH-MC-1實驗室微波合成儀（祥鵠科技）；DHG-9075A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；UV-315紫外可見分光光度計（日本島津公司）；Nicolet-5700紅外吸收光譜（美國熱電儀器有限公司）；RF-6000熒光光譜儀（日本日立公司）；X Pert pro X-射線衍射儀（荷蘭帕納科）；UItra55高分辨冷場發射掃描顯微鏡（德國卡爾·蔡司NTS有限公司）；SDT Q160熱分析儀（美國TA儀器公司）。

1.3 方法

1.3.1 竹葉花椒中黃酮的提取

將竹葉花椒果皮用粉碎機粉碎，稱取適量粉末，加入原料30倍的60%乙醇溶液，用微波輔助法提取，提取溫度80 ℃，提取時間25 min，微波功率400 W，提取液先進行抽濾，濾液用旋轉蒸發儀進行濃縮，用石油醚進行脫脂處理[11]，冷凍干燥得到黃酮粗提物；用聚酰胺-大孔吸附樹脂聯用的方法進行純化[12]，得到淡黃色粉末狀黃酮純化物。

1.3.2 紫外可見光譜測試

分別稱取黃酮粗提物黃酮純化物適量，用60%乙醇溶液溶解，利用UV-315紫外可見分光光度計掃描，掃描范圍為200～800 nm。

1.3.3 紅外吸收光譜測試

利用Nicolet-5700紅外光譜儀掃描制備好的黃酮粗提物與純化物的溴化鉀片，分辨率0.4 cm-1，掃描波長范圍為400～4 000 cm-1。

1.3.4 X-射線衍射測試利用X Pert pro X-射線衍射儀對制備好的黃酮粗提物和純化物進行測試，其掃描角度3°～80°。

1.3.5 掃描電鏡測試

將黃酮粗提物和純化物粉末用導電膠固定在樣品臺上，進行噴金處理，利用UItra55高分辨冷場發射掃描電子顯微鏡對其形貌進行觀察。

1.3.6 熒光光譜測試

分別稱取黃酮粗提物和純化物適量，用60%乙醇溶液溶解，利用RF-6000熒光光譜儀進行測試，激發光波長365 nm，掃描范圍為385～710 nm。

1.3.7 熱重測試

利用SDT Q160熱分析儀對黃酮粗提物和純化物進行測試，測試氛圍為N2，N2流速100 mL/min，升溫范圍為室溫-800 ℃，升溫速率10 ℃/min。

2 結果與分析

2.1 竹葉花椒黃酮的紫外可見光譜

竹葉花椒黃酮粗提物與純化物的紫外可見光譜圖如圖1所示。粗提物的吸收峰位于259.5，269.5，279.5和328 nm，其中259.5和279.5 nm為肩峰；粗提物的吸收帶Ⅰ較弱，吸收帶Ⅱ較強，在吸收帶Ⅱ處伴有雙肩峰，這可能是由于提取物中異黃酮或二氫黃酮等引起[13]。樣品經純化后，其紫外可見光譜主要有2個吸收峰，分別位于279和330 nm處，未見肩峰。黃酮類化合物具有C6—C3—C6這一基本結構，其紫外光譜在220～400 nm范圍內一般有2個主要吸收帶，峰帶Ⅰ（300～400 nm）和峰帶Ⅱ（220～280 nm），帶Ⅰ主要是B環肉桂酰生色團的電子躍遷產生的吸收帶，帶Ⅱ主要是A 環的苯甲酰生色團的電子躍遷產生的吸收帶[14]，由此推斷竹葉花椒黃酮具有黃酮類化合物的紫外特征吸收峰。其中帶Ⅰ內的吸收峰峰寬大而且不夠尖銳，其造成的原因可能是提取物在300～400 nm內有吸收峰的物質較多，即B環取代基的位置復雜[15]。

圖1 黃酮粗提物（a）與純化物（b）的紫外可見光譜圖

2.2 竹葉花椒黃酮的紅外吸收光譜

竹葉花椒黃酮粗提物和純化物的紅外光譜圖如圖2所示。黃酮粗提物和純化物的紅外吸收特征峰相似，在3414 cm-1處有1個極強的吸收峰，這是酚羥基的特征譜峰[16]；2973 cm-1處為甲基C—H的反對稱伸縮振動吸收峰；2928 cm-1處為亞甲基C—H的反對稱伸縮振動吸收峰；1669 cm-1處為羰基C＝O的伸縮振動吸收峰[17]；1627，1518和1450 cm-1為苯環骨架的振動吸收峰；1385 cm-1處為甲基C—H的對稱變角振動吸收峰；1300 cm-1以下，1284，1160，1048和955 cm-1等是糖環中的C—O的伸縮振動吸收峰；880，824和767 cm-1為芳環上CH的面外彎曲振動吸收峰。黃酮純化物與粗提物相比，黃酮純化物的紅外光譜分辨率更高，特征官能團更加突出。

圖2 黃酮粗提物（a）和純化物（b）的紅外光譜圖

2.3 竹葉花椒黃酮的結晶性

竹葉花椒黃酮粗提物和純化物平滑后的X-射線衍射圖如圖3所示。黃酮純化物在23°附近有一個衍射強度弱的寬峰，這是一個典型的無定型粉末特征衍射峰，其他位置幾乎沒有衍射峰，由此推斷黃酮純化物為無定型粉末；黃酮粗提物在28.3°，40.5°和66.3°有強度弱的衍射峰出現，在23°附近有一個衍射強度弱的寬峰，也由此推斷黃酮粗提物為無定型粉末。

圖3 黃酮粗提物（a）和純化物（b）的X-射線衍射圖

2.4 竹葉花椒黃酮的微觀形貌

竹葉花椒黃酮粗提物和純化物的掃描電鏡如圖4所示。圖4（a和b）分別是黃酮粗提物在500倍和5000倍下的微觀形貌，圖4（c和d）分別是黃酮純化物在500倍和5000倍下的微觀形貌。由圖4可見，黃酮粗提物在高倍鏡下可以明顯地觀察到片狀、棒狀、橢圓狀和微球等結構。其中，片狀、棒狀、橢圓狀的形貌不規整，尺寸大小不均一，主要在幾個微米和幾十個微米之間；微球狀結構的形貌規整，但分布不均勻，尺寸大小約1 μm左右。黃酮純化物在高倍鏡下可以明顯的觀察其大部分都是形貌比較規整的微球，尺寸大小主要為1 μm左右，此外還具有薄膜狀結構。

圖4 黃酮粗提物（a和b）和純化物（c和d）的掃描電鏡圖

2.5 竹葉花椒黃酮的發光特性

竹葉花椒黃酮粗提物和純化物在365 nm激發波長下的熒光發射光譜圖如圖5所示。它們都具有2個明顯的熒光發射峰，黃酮粗提物發射峰位分別在450 nm和670 nm；黃酮純化物發射峰分別位于457 nm和667 nm。熒光是電子從第一激發單重態躍遷回基態所產生的降級輻射[18]，能強烈發光的分子幾乎都是通過吸收π→π*躍遷而達到電子激發態的，一般只有那些具有共軛雙鍵，尤其是具有剛性平面和多環結構的分子才有利于發光，黃酮是一類具有多環結構的物質，因此黃酮類物質會具有較強的熒光性能。黃酮純化物的熒光性能比粗提物的強，這是由于黃酮純化物中黃酮類物質的含量更高，具有多環結構的分子更多，更有利于發光。

圖5 黃酮粗提物（a）和純化物（b）的熒光發射光譜圖

2.6 竹葉花椒黃酮的熱穩定性

竹葉花椒黃酮粗提物和純化物的熱重（thermogravimetric，TG）和微商熱重（derivative thermogravimetry，DTG）曲線見圖6。由黃酮粗提物和純化物主要有4個失重階段，第1個階段主要是提取物中吸附水和結晶水的損失[19]，第2個階段主要是提取物中的一些黃酮類物質和其他有機物的分解，第3個階段提取物的失重區間較短，失重率較低，可能是由于提取物中的某一種黃酮類物質分解導致，第4個階段提取物在到達最快失重溫度264 ℃后，失重率逐漸降低，這時提取物進入預碳化階段[20]，具有較高熱穩定性的黃酮類物質開始分解，溫度達到700 ℃后質量變化不大，提取物在該溫度下幾乎完全碳化。黃酮純化物的熱穩定性比粗提物更好，殘炭率分別為40.28%和34.09%。

圖6 黃酮粗提物（上）和純化物（下）的TG和DTG曲線

3 結論

運用現代分析測試技術對竹葉花椒黃酮粗提物和純化物的結構與性能進行研究。紫外光譜表明黃酮提取物中有黃酮類物質的特征吸收帶；紅外光譜表明提取物中具有酚羥基、羰基和苯環等黃酮類物質的特征振動吸收峰；X-射線衍射圖譜表明提取物為無定型粉末；掃描電鏡表明提取物為1 μm左右的球狀結構；提取物在365 nm激發波長下會在450 nm和670 nm左右分別發出藍色和紅色的熒光；純化黃酮的加熱失重率達60%，主要有4個失重階段，最快失重溫度為264 ℃。