海南島近岸貝類中腹瀉性毒素污染情況調查研究

梁瓊，張玉霞，趙曉野*，王婷

1. 海南省食品藥品檢驗所海口分所（海口 570311）；2. 海南省工商職業學院（海口 570203）

腹瀉性貝毒（diarrhetic shellfish poison，DSP）是由有毒甲藻類鰭藻屬（Dinophysis）和原甲藻屬（Prorocentrum）中部分藻種產生的一類熱穩定的脂溶性多環醚類化合物，主要成分為軟海綿酸（oka-daic acid，OA）及其衍生物，因其分布廣泛、對人類致毒性強而成為備受關注的海洋生物毒素之一。貝類通過濾食有毒藻類而在體內積累毒素，當人們誤食染毒的貝類后就會造成中毒，癥狀主要表現為腹瀉，與一些普通腹瀉癥狀相似，所以往往被人們忽視。由于腹瀉性貝類中毒現象普遍存在，且分布較廣、致毒性強，故被列為世界食品衛生學重要問題之一。DSP不僅能造成急性中毒，也能引起潛在的慢性中毒，而且DSP中主要成分OA是一種很強的腫瘤促進劑，具有一定的促癌作用[1-2]，可誘發消化系統癌變。盡管致癌機理目前還不十分清楚，但應當引起人們對海產貝類食用安全的高度關注。已有研究報道，我國沿海大部分海域都存在DSP污染[3-5]。南海海域、廣東沿海、福建沿海、浙江海域、上海水產市場均發現DSP[6-11]，超標率較高，個別海域超標率竟達77%。

海南島是我國唯一的熱帶島嶼，有著豐富的海洋資源和得天獨厚的生態環境，為熱帶貝類養殖提供了有利條件，貝類養殖品種多樣化。隨著近年來該海域有毒赤潮的不斷發生，該海域養殖貝類的食用安全存在較大風險，但關于海洋毒素在海南島貝類中染毒狀況的研究卻非常少見[12]，據僅有可查資料顯示，胡蓉等[13]研究發現海南島海域貝類DSP全年陽性檢出率和超標率較高，污染狀況較為嚴重。楊美蘭等[14]研究發現2006年海南海區的榆林港水域和2007年海南海區的八所港等5個養殖水域牡蠣體中DSP呈陽性。吳施衛等[3]研究發現海南主要的DSP染毒海域是陵水赤控區、海口、鶯歌海、三亞及洋浦等地。

此次研究對海南島常見的貝類設了5個觀測點，進行為期一年四季的檢測追蹤，調查腹瀉類貝毒污染狀況，為貝類食品安全性評價和毒素檢測分析提供基礎數據和理論依據，為海南省提高和改善水產品的質量及安全性提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年9月至2020年8月為期一年間，在海南省海口（HK）、文昌（WC）、瓊海（QH）、三亞（SY）、儋州（DZ）、東方（DF）6個站點進行貝類樣品采集，共采集到17種貝類323個樣品，主要品種為菲律賓蛤仔、魁蚶、櫛江珧、波紋巴非蛤、華貴櫛孔扇貝、裂紋格特蛤、翡翠貽貝、鈍綴錦蛤、方斑東方螺、蟶子等，均為當地主要經濟養殖的貝類。樣品采集時了解確認其產地信息，樣品采集后迅速送至實驗室，用自來水洗去貝類外殼附著物，用刀將貝類的軟組織與貝殼分離，并用去離子水沖洗附著內部的殼屑，充分瀝干水分，勻漿機均質，編號后置于樣品管中，貯存于-24 ℃低溫冰箱待測。

1.2 儀器和設備

液相色譜-串聯質譜儀（配有電噴霧離子源，Agilent 6460）；PL602L天平（梅特勒）；B-400組織均質器（瑞士步琪）；渦旋振蕩器（Heidolph Multi Reax）；3-18K離心機（德國西格瑪）；超聲波清洗器（昆山舒美KQ-400ES）；YGC-24D氮吹儀（雅源科技）。

1.3 檢測方法

試驗采用了在GB 5009.212—2016《食品安全國家標準貝類中腹瀉性貝類毒素的測定》液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）基礎上，實驗室進行優化后的方法。取樣2 g于50 mL具塞離心管中，加入9 mL甲醇，渦旋混合1 min，超聲提取10 min，在8 000 r/min下離心5 min，移出上清液。殘渣中加入9 mL甲醇，重復提取1次，合并提取液。將上清液轉入分液漏斗中，用15%（體積分數）二氯甲烷/正己烷溶液脫脂3次（每次15 mL），加5 mL水，再用50%（體積分數）二氯甲烷/正己烷溶液萃取3次（每次15 mL），合并二氯甲烷層，用無水硫酸鈉脫水后旋轉蒸發至近干，然后用氮吹儀吹干，用甲醇定容至1 mL，置于螺紋口樣品瓶中，加入125 μL氫氧化鈉溶液（2.5 mol/L），混勻后用密封膜將瓶密封，在76 ℃條件下溫浴40 min，冷至室溫后，加入125 μL鹽酸溶液（2.5 mol/L）并混勻，所得水解液（1.25 mL相當于2 g試樣）可直接過0.22 μm有機相微孔濾膜后，供液相色譜-串聯質譜測定。

1.4 檢測條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C182.1×100 mm，1.7 μm；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；流動相：A為甲酸銨溶液（2 mmol/L），B為乙腈+甲酸銨溶液（2 mmol/L）（95+5，V/V）；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；負離子掃描模式；檢測方式：多反應檢測（MRM）；電噴霧電壓：4 000 V；毛細管溫度：300 ℃；各組分監測離子及對應碰撞能量見表2。

表2 DSP監測離子及碰撞能量

1.5 計算方法

OA、DTX-1和DTX-2根據對應標準回歸方程進行含量計算。試樣中腹瀉性貝類毒素總毒力按OAeq=×ri計算。式中：Xi為各種腹瀉性貝類毒素的含量；ri為毒性因子（rOA=1，rDTX-1=1，rDTX-2=0.6）。

2 結果與分析

2.1 DSP毒素質譜圖

取空白試樣，按照與試樣相同的分析步驟處理，制成基質標準曲線，如圖1所示。

圖1 OA標準曲線圖

圖2 DTX-1標準曲線圖

OA、DTX-1，DTX-2的各自的質譜圖如圖4所示。OA和DTX-2為同分異構體，OA比DTX-2出峰時間早。

圖4 OA、DTX-1，DTX-2多反應監測離子色譜圖

圖3 DTX-2 標準曲線圖

2.2 全年DSP污染情況

根據GB 5009.212—2016液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）方法規定，OA、DTX-1，DTX-2的檢出限均為10.0 μg/kg，定量限均為30.0 μg/kg，同時方法認為任何腹瀉性貝類毒素含量大于16 μg/100 g的樣品即被認為是有害的，對人類食用不安全。海南島近岸腹瀉性貝毒污染狀況調查結果發現，全年抽樣量共323個樣品，共有28個樣品檢出含量超過10.0 μg/kg，其中有6個樣品檢出含量超過30.0 μg/kg，1個樣品超16 μg/100 g。

表3 全年DSP檢測情況統計分析

2.3 不同季節貝類DSP毒素污染情況

海南島近岸貝類DSP含量存在一定的季節差異性。從表4可以看出：2019年冬季，檢驗貝類樣品共59份，DSP檢出有12份，檢出率為20.3%；2020年春季，檢驗貝類樣品共90份，DSP檢出有6份，檢出率為6.7%；2020年夏季，檢驗貝類樣品共89份，DSP檢出有0份，檢出率為0；2019年秋季，檢驗貝類樣品共85份，DSP檢出有10份，超標1份，檢出率和超標率分別為11.8%和1.2%。貝類DSP含量在冬季檢出率最高，秋季次之，染毒含量最高的樣品出現在秋季，春季較低，夏季樣品都未檢出。就檢出率而言，2019年冬季＞2019年秋季＞2020年春季＞2020年夏季。

表4 不同季節DSP檢測情況統計分析

2.4 不同海域貝類DSP毒素污染情況

海口海域共采集樣品54份，DSP檢出有7份，超標1份，檢出率和超標率分別為13.0%和1.9%；文昌海域共采集樣品52份，DSP檢出有9份，檢出率為17.3%；瓊海海域共采集樣品54份，DSP檢出有1份，檢出率為1.9%；三亞海域共采集樣品53份，DSP檢出有3份，檢出率為5.7%；儋州海域共采集樣品54份，DSP檢出有6份，檢出率為11.1%；東方海域共采集樣品55份，DSP檢出有2份，檢出率為3.6%。海南島近岸貝類都有受貝類DSP毒素污染的狀況發生，但總體上毒素含量不高。就檢出率而言，文昌＞海口＞儋州＞三亞＞東方＞瓊海。如表5所示。

表5 不同海域DSP檢測情況統計分析

2.5 不同貝類累積DSP毒素特征

此次調查檢測共采集到17種貝類323個樣品，主要品種為菲律賓蛤仔41份、魁蚶31份、櫛江珧12份、波紋巴非蛤31份、華貴櫛孔扇貝12份、裂紋格特蛤53、翡翠貽貝17份、鈍綴錦蛤47份、方斑東方螺9份，蟶子29份及其他41份。其他種類貝類均為3～5份，均未檢測出貝類DSP毒素。檢出率最高的是波紋巴非蛤、華貴櫛孔扇貝、翡翠貽貝，高達20%以上，最低是蟶子，檢出率從高到低依次為波紋巴非蛤＞華貴櫛孔扇貝＞翡翠貽貝＞方斑東方螺＞裂紋格特蛤＞櫛江珧＞魁蚶＞菲律賓蛤仔＞鈍綴錦蛤＞蟶子=其他。主要品種染毒情況如下表6所示。

表6 不同貝類品種DSP檢測情況統計分析

3 討論

目前貝類毒素檢測方法有小鼠生物測定（MBA）法、酶聯免疫吸附測定（ELASA）法、高效液相色譜-熒光法、高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）法等。雖然MBA法是腹瀉性貝類毒素最普遍的檢測方法，但該方法需大量使用小鼠，不符合“3R”的要求[15]，而且由于靈敏度低、準確性和重現性差、易出現假陽性、不具有特異性、無法確定毒素的成分、結構和含量、浪費實驗材料等缺點，限制了此方法的推廣；ELASA試劑盒雖靈敏度高、操作簡單，但其試劑盒昂貴，有類似物干擾作用，會出現假陽性或對毒性估計不準確的情況[16]，不適合日常監測使用；高效液相色譜-熒光法是國內外目前常用的貝類毒素檢測方法，分析過程中使用的柱衍生試劑如ADAM價格昂貴[17]，同時還須另配柱后衍生裝置，檢測所需的熒光試劑在室溫下不穩定，背景干擾對試驗結果影響大，操作繁瑣，不易穩定，重復性差，因此其應用受到一定的限制；此次研究采用了高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）法，該測定方法是近年興起的一種檢測技術，比其他方法重復性好，不會出現假陽性，是一種能夠準確定性定量，并能夠提供準確的分子結構信息的新型分離技術[18]。在眾多的分析測試方法中，HPLC-MS/MS以其同時具備高特異性和高靈敏度的特點而被廣泛應用于生物毒素研究領域。

在此次檢測的323個樣品中，共有28個樣品檢出含量超過10.0 μg/kg，檢出率為8.7%，最大的一個檢出含量為180 μg/kg。根據2001-10-01實施的國家標準GB 18406.4—2001《無公害食品水產品中有毒有害物質限量》中規定水產品中DSP限量標準為60 μg/100 g可食部分，可判定該批次無陽性樣品。

導致DSP季節性差異的原因可能是季節不同，造成水體溫度、鹽度、光照等變化，進而影響藻類種群、數量和貝類的生理狀態。海南島海域浮游生物調查發現，該海域存在可能產生DSP的藻類有利瑪原甲藻和D.caudata等[19]，且浮游植物細胞密度的季節變化呈冬季初期最高、秋季次之、夏季最低的趨勢[20]。此次研究發現冬季檢出率最高、秋季次之、春季較低、夏季樣品都未檢出。海南島海域貝類中DSP的季節性變化與浮游植物的季節變化間可能存在一定聯系。而黃翔等[4]通過分析南海海域赤潮高發期，得出南海海域近岸貝類DSP毒素陽性檢出率和超標率在春季較高。海南島東線海域屬于南海海域，而西線卻在北部灣海域，這也可能是造成與之不一樣的原因。根據胡蓉等[13]的調查研究，其對不同貝類品種的季節性差異的分析，可以得出不同的貝類品種季節性的染毒情況不一樣，這也可能是取樣不同品種數量的多少，導致貝類季節性差異不一樣的結果。

海南島不同海域，由于潮流和風浪的作用，可能對形成赤潮的浮游生物有很大影響。基于風浪和潮流條件，海南島東南海域擴散條件不如西北海域，同時一些海灣存在沿岸流，不僅輸送浮游生物所需的營養物質，還可能攜帶形成赤潮的浮游生物，因此海南島東南部的浮游甲藻較多。在此次調查中，東線海岸比西線海岸檢出率高，含量最高的出現在海口海域，檢出率最高是文昌。在海南島貝類養殖中，文昌養殖面積最大，產生大量污染物流入近岸，海域營養化，促使產毒藻類富集，增加該海域貝類染毒概率。此外沿海城市經濟的快速發展，使大量污染物排放到周圍水體，造成海水營養化導致赤潮發生，因此經濟發達的省市污染狀況往往更嚴重，這可能是含量最高的出現在海口海域的原因。

貝類的種類對DSP的積累存在差異性。貝類自身對DSP吸攝食率以及對毒素吸收和代謝能力，是影響貝類DSP積累的重要因素之一。Viviani[21]研究發現，貽貝積累DSP的能力最強、扇貝次之、牡蠣的能力最弱。徐志斌等[8]研究發現翡翠貽貝和牡蠣染毒比例大，而吳施衛等[7]在檢測的樣品中發現波紋巴非蛤超標情況最多。楊美蘭等[14]對南海海域牡蠣體中的DSP進行調查，結果表明牡蠣是較易積累DSP的。此次研究結果顯示波紋巴非蛤檢出率最高，華貴櫛孔扇貝和翡翠貽貝次之，因此波紋巴非蛤、華貴櫛孔扇貝和翡翠貽貝較易累積DSP。有研究發現：有的貝類在攝食有毒藻后，累積毒素而中毒死亡；有的種類會不同程度地關閉貝殼膜瓣，收縮水管，降低攝食率就減少毒素累積；而有的種類則未發生異常反應。因此，導致貝類體內所含毒素不同[8,21]，所以不同貝類積累DSP存在一定的差異性。

總之，從監測結果上看，海南島近岸DSP的檢出率較低，污染狀況雖然不是很嚴重，但貝毒本身在環境中存在，食用安全的潛在風險不容忽視，對人類的影響有待進一步研究。為了更全面了解該地區貝類毒素的特征，需要在更大的海區范圍內選取更多的貝類進行監測，以確保其質量和安全性，保障人們的飲食和生命安全。