動物雙岐桿菌乳亞種HCS04-002小鼠體內功能性研究

閔祥博，湯純，矯艷平，余萍，趙迪

江西仁仁健康產業有限公司（樟樹 331200）

乳糖（lactose）是雌性哺乳動物特有的一種二糖，僅存在于乳汁中；乳糖無法被人體吸收，在腸道內被一種消化酶——乳糖酶消化分解成能被人體吸收的葡萄糖和半乳糖[1]。

乳糖酶（lactase）又稱β-半乳糖苷酶（β-galac-tosidase），是位于人體小腸絨毛的一種消化酶[2]，乳糖酶是由小腸黏膜表面絨毛的頂端處分泌，在所有雙糖酶中成熟最晚、含量最低，最易受損，修復又最慢[3]；該酶可催化分解乳糖，同時乳糖酶還具有半乳糖苷的轉移作用。

乳糖不耐受癥（lactose intolerance，LI）是指與乳糖不完全消化相關的胃腸道癥狀，即由于小腸上皮細胞乳糖酶（也稱β-半乳糖苷酶）缺乏，乳制品中的乳糖不能被分解吸收，從而進入結腸，被腸道細菌分解后，產生大量短鏈脂肪酸和氫氣，造成滲透壓升高，使腸腔內的水分增多，引起腹痛、脹氣和腹瀉等消化不良癥狀，稱為乳糖不耐受癥[4]。

乳糖不耐受癥的機制尚不清楚，除了乳糖酶缺乏，還包括乳糖消化量、胃腸道傳送、直腸動力異常、性別、年齡等因素[5]。除表現為乳糖不耐癥之外，還存在乳糖代謝不良但不表現出癥狀的人群，通常稱為乳糖吸收不良（lactose malabsorption，LM），即二糖消化不良，進而導致乳糖不耐受。乳糖不耐癥與乳糖吸收不良合稱為乳糖酶缺乏（lactase deficiency，LD）。乳糖酶缺乏是一種廣泛存在的世界性問題，影響全世界近2/3的人口，亞洲患病率高達95%，LD對人類的健康造成很大的威脅[6]。既往研究顯示[7-8]，含乳糖飲食可以有效提高鈣質吸收，相反地，無乳糖飲食會降低鈣質吸收率。乳糖不耐受，特別是無乳糖飲食可能會導致骨鹽沉積不充分等健康問題。乳糖不耐受癥的治療主要方式有添加乳糖酶，飲食調理，應用益生菌等。現如今關于解決乳糖不耐受問題的方法，均還有待完善。如食用低（無）乳糖制品，但無法長期滿足患者營養需求[9]；口服乳糖酶通常需要長期治療且價格昂貴，且胃內pH等因素均會影響乳糖酶的功效[10]；而改變基因又相對復雜且技術不成熟，仍處于試驗階段[11]。因此，應用益生菌緩解乳糖不耐受癥的研究就顯得尤為重要。

研究表明多種益生菌可產生乳糖酶[12-13]，同時可延緩胃排空速率，減慢腸轉運時間[12]，改善腸道微生態平衡[14]。雙歧桿菌、乳酸桿菌能酵解乳糖，在酵解乳糖時只產酸不產氣，不增加滲透壓，同時增加腸道短鏈脂肪酸的吸收，有利于減輕乳糖不耐受癥狀。另有研究表明，所有雙歧桿菌均具有乳糖酶，且活力顯著高于其他腸道菌群，因此適量補充雙歧桿菌可預防和緩解乳糖不耐受病癥的發生[15]。試驗通過測定益生菌菌株的β-半乳糖苷酶酶活和小鼠小腸的β-半乳糖苷酶酶活，研究動物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002對緩解乳糖不耐受癥的益生作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗菌株

動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.Lactis）HCS04-002及其凍干菌粉、鼠李糖乳桿菌HCS01-008、羅伊氏乳桿菌HCS02-004、植物乳桿菌HCS03-012、嗜熱鏈球菌HCS07-002、發酵乳桿菌HCS08-027、德氏乳桿菌保加利亞亞種HCS10-002、副干酪乳桿菌HCS17-044、瑞士乳桿菌HCS23-055：江西仁仁健康產業有限公司；動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002菌株：2020年3月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.19509。

1.1.2 試驗動物

清潔級昆明種（KM）小鼠50只，5周齡，18～22 g，雄性。小鼠飼料為無菌塊狀鼠料，均由遼寧長生生物技術有限公司提供。

1.1.3 主要培養基及培養條件

乳桿菌MRS培養基配方（液/固）：酵母蛋白胨1%，牛肉粉0.3%，酵母浸出物0.4%，磷酸二氫鉀0.2%，檸檬酸0.2%，乙酸鈉0.5%，葡萄糖2%，硫酸鎂0.058%，硫酸錳0.025%，吐溫-80 0.06%，番茄汁1%（V/V），瓊脂2%，調至pH 6.50；115 ℃，30 min滅菌。

乳桿菌MRS-lac培養基配方（液）：酵母蛋白胨1%，牛肉粉0.3%，酵母浸出物0.4%，磷酸二氫鉀0.2%，檸檬酸0.2%，乙酸鈉0.5%，乳糖2%，硫酸鎂0.058%，硫酸錳0.025%，吐溫-80 0.06%，番茄汁1%（V/V），調至pH 6.50；115 ℃，30 min滅菌。

培養條件：37 ℃，固體培養36～48 h，二級為單菌落至5 mL培養基培養20 h，三級為菌液5%接種量于100 mL培養基中培養17 h，正常培養。

雙歧桿菌培養基配方（液/固）：酵母蛋白胨3%，酵母浸出物2%，葡萄糖2.5%，低聚果糖0.5%，L-蘋果酸0.5%，調至pH 7.20，（瓊脂2%）115 ℃，30 min滅菌。

雙歧桿菌MRS-lac培養基配方（液）：酵母蛋白胨3%，酵母浸出物2%，乳糖2%，L-蘋果酸0.5%，調至pH 7.20；115 ℃，30 min滅菌。

培養條件：39 ℃，固體厭氧培養36～48 h，二級為單菌落至5 mL培養基培養20 h，三級為菌液5%接種量于100 mL培養基中（裝液量100%）培養17 h，蓋錫紙培養。

1.1.4 主要試劑

鄰硝基酚（ONP，分析純AR，MACKLIN）；磷酸二氫鉀（KH2PO4，分析純AR）、三水磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O，分析純AR）、二水EDTA（C10H14N2Na2O8·2H2O，分析純AR）、2-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG，生化試劑BR）、無水碳酸鈉（Na2CO3，分析純AR）（均為中國醫藥集團有限公司）；全脂乳粉（齊齊哈爾菲格瑞斯食品有限公司）。

1.1.5 主要儀器與設備

恒溫培養箱（DHP-500BS，北京市永光明醫療儀器有限公司）；厭氧工作站（LAI-3DT，上海龍躍儀器設備有限公司）；低溫高速離心機（TGL-16M，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；超聲波細胞粉碎機（SCIENTZ-ⅡD，寧波新芝生物科技股份有限公司）；酶標儀（Multiskan FC，賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1β-半乳糖苷酶的測定

按照GB/T33409—2016《β-半乳糖苷酶活性檢測方法分光光度法》[16]并參考文獻[17-18]方法進行改進。

1.2.1.1 標準曲線的繪制

稱取0.1390 g鄰硝基苯酚（ONP）于小燒杯中，加10 mL 96%乙醇溶解，將溶液轉移入1 L容量瓶中，加水定容搖勻。

用移液管分別從這些溶液中移取2，4，6，8，10，12和14 mL溶液至不同100 mL容量瓶中，各加入25 mL碳酸鈉溶液，用緩沖液定容搖勻，制成0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12和0.14 mmol/L的ONP，用無菌水作空白。

以鄰硝基苯酚的濃度為橫坐標，以稀釋液的吸光度ΔA420nm為縱坐標做標準曲線，得出回歸方程。

1.2.1.2β-半乳糖苷酶活力的測定試驗（ONPG法）

將培養17 h后的發酵液15 mL于10000 r/min 4 ℃離心5 min。收集菌泥，用等體積的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.80）洗滌2次。將菌體重懸于3 mL上述磷酸鹽緩沖液中，進行超聲破碎。破碎條件：超聲功率200 W、工作時間/間隔時間1 s/9 s、60次、4 ℃。10 000 r/min 4 ℃離心20 min取上清液，即得粗酶液。將粗酶液進行適當稀釋，取粗酶液200 μL于30 ℃下水浴預熱5 min，加入同樣在30 ℃預熱5 min的ONPG溶液1 mL，搖勻，在30 ℃下水浴10 min，立即加入400 μL碳酸鈉溶液來終止反應。30 min內于420 nm處測定OD值。

反應緩沖液的配制：稱取8.8 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）、8.0 g三水磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）、0.25 g七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）和18.6 mg二水EDTA（C10H14N2Na2O8·2H2O）溶解于900 mL水中，轉入1000 mL容量瓶中，用水定容并搖勻，緩沖液的pH應在6.50±0.05之間。

ONPG底物溶液的配制：將250.0 mg鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）溶解在約80 mL反應緩沖液中，接著轉移到100 mL的容量瓶中，用反應緩沖液定容，搖勻，最早在用前2 h制備。

碳酸鈉溶液的配制：將50 g碳酸鈉（Na2CO3）和37.2 g二水EDTA溶解在約900 mL水中，定容至1000 mL。

空白樣的制備：將添加ONPG底物和碳酸鈉溶液的順序顛倒，其余步驟與樣品處理方式相同。

1.2.1.3 試驗結果計算方法

1個酶活力單位（E）定義為：在30 ℃每分鐘水解釋放1 μmoL ONP所需的酶量。按式（1）計算酶活E（U/mL）。

式中：E為發酵液中酶活力，U/mL；f為測定酶液的稀釋倍數；V為反應體系總體積，1.6 mL；K為標準曲線斜率，3.162 5；t為反應時間，10 min；V1為酶液體積，0.2 mL。A420nm為在420 nm波長處的吸光度。

1.2.2 小鼠小腸乳糖酶測定試驗

1.2.2.1 小鼠分組灌胃

將4周齡的雄性KM小鼠（20.0±2.0 g）飼養于鼠籠中，保持溫度25±0.5 ℃，相對濕度50%±5%，并執行12 h/12 h的燈光/黑暗循環。所有小鼠給予相同量的基本膳食，并提供足夠的飲用水，適應性喂養1周后開始試驗。小鼠隨機分為5組：對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，分別經口灌胃純水、12%全脂乳粉溶液、12%全脂乳粉和益生菌粉混合溶液（詳見表3），益生菌菌粉灌胃劑量分別為1，2和4 g/kg體重（即每100 mL 12%全脂乳粉溶液中分別添加10，20和40 g益生菌菌粉），灌胃體積為10 mL/kg，灌胃量根據灌胃前每只小鼠的體重調節。每天上午灌胃1次，在灌胃28 d的24 h后，處死小鼠進行后續分析，每組小鼠10只[19]。每日記錄小鼠的體重，觀察其攝食量和飲水量是否正常，精神狀態、活躍程度和皮毛光澤是否發生異常[20]。

表1 各試驗組與對照組設置

1.2.2.2 小鼠小腸乳糖酶的測定

摘取KM小鼠小腸測定其乳糖酶活性。具體操作為：處死小鼠，立即取其胃幽門以下小腸腸段作為待測標本，用移液管取預冷的0.85%冷生理鹽水，其體積總量應是小腸重量的9倍，用超聲波細胞粉碎機（SCIENTZ-ⅡD）于冰浴中低速勻漿1 min，勻漿時間10 s/次，間隙30 s，連續6次，在冰（水）中進行，然后低溫以3 000 r/min離心10 min取上清液。將上清液進行適當稀釋，取上清稀釋液200 μL于30 ℃下水浴預熱5 min，加入同樣在30 ℃預熱5 min的ONPG溶液1 mL，搖勻，在30 ℃下水浴10 min，立即加入400 μL碳酸鈉溶液來終止反應。30 min內于420 nm處測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 菌株β-半乳糖苷酶活性測定

對自有9株乳酸菌菌株進行β-半乳糖苷酶酶活測定，測定結果詳見表2。動物雙岐桿菌乳亞種HCS04-002的β-半乳糖苷酶酶活最高，酶活為0.758 U/mL。有研究表明雙歧桿菌可以產生乳糖酶[21-22]，試驗表明動物雙岐桿菌乳亞種HCS04-002可明顯產β-半乳糖苷酶。因此，選用動物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002進行后續的小鼠試驗。

表2 各菌株β-半乳糖苷酶酶活數據

2.2 小鼠小腸β-半乳糖苷酶活性測定

乳糖酶是動物體內消化分解乳糖的主要酶源。由圖1可知，全脂乳粉和益生菌的加入，使小鼠小腸內容物β-半乳糖苷酶的活性高于對照組，且具有統計學差異（p＜0.05），可見動物雙歧桿乳亞種HCS04-002可促進小腸中β-半乳糖苷酶的恢復和增加。動物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002低劑量組試驗小鼠小腸的β-半乳糖苷酶活性高于對照組的，但與模型組相比無顯著差異；中劑量組和高劑量組試驗小鼠小腸的β-半乳糖苷酶活性明顯高于對照組和模型組，說明在此劑量下HCS04-002對乳糖不耐受有一定調節能力。

圖1 各組別小鼠小腸β-半乳糖苷酶活性

3 結論

試驗結果表明，動物雙岐桿菌乳亞種HCS04-002可以產生β-半乳糖苷酶且酶活較高；經28 d的動物雙歧桿乳亞種HCS04-002處理后，劑量達到2 g/kg時，小鼠小腸的β-半乳糖苷酶活性明顯升高，說明動物雙歧桿乳亞種HCS04-002表現出有一定的緩解乳糖不耐受的功能。試驗發現，2 g/kg劑量組和4 g/kg劑量組之間沒有表現出明顯的酶活量效關系，這可能與該株菌緩解乳糖不耐受機理或者給樣時間較短有關。試驗僅對給樣后KM小鼠小腸的β-半乳糖苷酶酶活進行測定，后續可增加測定小鼠臟器指數、血清和肝臟指標、小腸指標等，還可以考慮通過16SrRNA測序，分析小鼠結腸內容物的微生物菌群的多樣性和豐度的變化等[23-24]，以期更全面地了解動物雙歧桿乳亞種HCS04-002緩解乳糖不耐受癥的機理，為進一步開發和應用提供數據支持。