發酵條件對三七葉發酵茶活性物質的影響及抗氧化研究

陳紅惠，向德健，高明菊，楊光領，龔雄彪

文山學院三七醫藥學院 （文山 663099）

三七葉，為五加科植物三七的葉，三七葉味稍帶苦味，不僅可用做茶飲，也可作為藥用，藥性比較溫和，且毒副作用較小?，F代藥理學研究表明，三七葉具有安神、抗氧化、抗衰老等功效[1-3]。三七葉用于治療跌打損傷、止血，研磨后敷在傷口上可以止血，功能和三七根相差不大。三七葉中除以皂苷成分為主外，還含有多酚、多糖、黃酮等活性成分[4-7]。目前，三七類產品被相繼研發出來，應用于不同的領域，主要有生活用品類、跌打損傷類和臨床類藥物，如三七牙膏[8]、三七散[9]、血塞通注射劑、血塞通膠囊等；在食品開發領域，三七葉類產品也相繼出現，如三七葉蜂蜜龜苓膏[10]、三七葉保健軟糖、三七葉花生酥糖[11-12]、三七莖葉紅茶飲料[13]、三七葉含片[14]等。

黑曲霉是安全的發酵微生物，適用于固態發酵，可生產淀粉酶、纖維素酶、檸檬酸等，用于發酵茶，發酵出來的茶的茶性比較溫和，口感顯香甜、風味醇厚且獨特。三七葉作為三七的副產物，一直沒能得到有效的開發和利用。研究以三七葉為原料，經過不同的制茶工藝后以黑曲霉發酵，得到三七葉發酵茶，不僅可以開發文山地方特色資源，提高三七的利用價值，還可以提高產物利用率，這對拓展三七葉食品市場、促進三七產業發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

三七葉產于云南文山；黑曲霉菌種：分離于云南普洱茶，經多代培養純化后并測序鑒定。

1.1.2 試劑

蘆?。ㄉ虾Ｔ慈~生物科技有限公司）；標準品人參皂苷Rb1（上海Aladdin公司）；沒食子酸、福林酚、香草醛、冰醋酸（上海易恩化學技術有限公司）；冰醋酸、高氯酸、抗壞血酸、95%乙醇（山東鑫九誠化工科技有限公司）；Tris（上海金穗生物科技有限公司）；鄰苯三酚、鹽酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸（湖北藝康源化工有限公司）。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MB90快速水分測試儀[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；鼓風恒溫干燥箱（上海龍躍儀器設備有限公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；離心機（上海安亭科學儀器廠）；粉碎機（九陽股份有限公司）；V-5100型可見光分光光度計（廣州滬瑞明儀器有限公司）；MJ-70-1霉菌培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.3 黑曲霉孢子菌懸液的制備

制作PDA培養基，將培養基以及需要用到的試劑、工具全部置于無菌操作臺上，紫外線消毒30 min，確保無雜菌污染，在無菌操作臺上接種黑曲霉，放入溫度為28 ℃、水分濕度85%的霉菌培養箱，培養至黑曲霉長滿培養皿為止。取出培養好的培養皿，用移液管吸取5 mL生理鹽水放入黑曲霉培養皿中，用接種針在斜面上輕輕刮取，將菌懸液倒入盛有生理鹽水的三角燒瓶中，充分振蕩，隨后用無菌脫脂棉和漏斗過濾，除去菌絲，將菌懸液稀釋到1.0×107CFU/mL。

1.4 三七葉發酵茶的制備工藝

1.4.1 工藝流程

1.4.2 操作要點

原料選擇：選擇鮮嫩且小的三七葉片。

殺青：殺青有炒青與蒸青兩種[15]方式。炒青：將洗凈后的葉子瀝干水分，放入大鍋小火慢炒，并不斷地翻炒；蒸青：將瀝干水分的葉子薄薄地鋪在蒸鍋里，水蒸氣上來后放入鍋里蒸三分鐘左右抬起，蒸出來的葉子水分太高不易揉捻成型，把葉子放入30 ℃鼓風恒溫干燥箱中干燥3～5 min拿出。

揉捻：將經過蒸青或炒青的葉子放在簸箕內不斷揉搓，直至成蜷條狀，不會散為止。

高溫滅菌：將揉捻好的三七葉放在溫度為105 ℃的高溫滅菌鍋內滅菌15 min。

稱取一定量經滅菌處理后的三七葉茶于培養瓶中，壓緊，按照接種量將稀釋后的菌懸液噴灑到三七葉上，用保鮮膜密封，扎上一定數量的小孔，放入培養箱中培養。

1.5 試驗方法

1.5.1 不同發酵條件下發酵三七葉發酵茶

1.5.1.1 不同殺青方式對三七葉發酵過程中化學成分的影響

分別取用蒸青、炒青處理過的三七茶葉（茶坯含水量為30%）各30 g放在培養瓶中壓緊，接種20%的黑曲霉，在30 ℃條件下發酵5，10，15，20和25 d，分別測定多酚、黃酮、皂苷的含量，并與未發酵的三七葉作對比。

1.5.1.2 不同發酵溫度對三七葉發酵過程中化學成分的影響

取30 g經炒青后的三七葉茶（茶坯含水量為30%）放在培養瓶中壓緊，接種20%的黑曲霉，分別在25，30，35，40和45 ℃下發酵10 d，分別測定多酚、黃酮、皂苷的含量。

1.5.1.3 不同發酵時間對三七葉發酵過程中化學成分的影響

取30 g經炒青后的三七茶葉放在培養瓶中壓緊，接種20%的黑曲霉，茶坯含水量為30%，在30 ℃下分別發酵5，10，15，20和25 d，分別測定多酚、黃酮、皂苷的含量，并與未發酵茶葉的理化指標作對比。

1.5.1.4 不同接種量對三七葉發酵過程中化學成分的影響

取30 g經炒青后的三七葉茶放在培養瓶中壓緊，分別接種6%，13%，20%，27%和33%的黑曲霉，茶坯含水量為30%，在30 ℃條件下發酵10 d，分別測定多酚、黃酮、皂苷的含量。

1.5.1.5 不同茶坯含水量對三七葉發酵過程中化學成分的影響

取30 g經炒青后的三七葉茶葉放在培養瓶中壓緊，茶坯含水量分別為10%，20%，30%，40%和50%，接種20%的黑曲霉，在30 ℃下發酵10 d，分別測定多酚、黃酮、皂苷的含量。

1.5.2 抗氧化試驗

1.5.2.1 超氧陰離子自由基（O2-·）清除試驗

參考陳紅惠等[20]的方法，有輕微改動。配制濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，調整其pH為8.2，然后分別取4.5 mL 6份置于各試管中，置于37 ℃水浴鍋中加熱20 min，加入不同質量濃度樣品液（0.00，0.40，0.44，0.48，0.52和0.56 mg/mL）2 mL，各管分別加入0.5 mL鄰苯三酚溶液，混合并置于27 ℃水浴鍋中水浴6 min，立刻加入鹽酸1.0 mL，測量波長為420 nm處的吸光度。測定對照品溶液時，鄰苯三酚用蒸餾水代替，其他樣品按照上述方式測定樣品吸光度計算清除率，用抗壞血酸作為對照。

1.5.2.2 羥基自由基（·OH）清除試驗

取2 mL不同質量濃度（0.28，0.32，0.36，0.40和0.44 mg/mL）的樣品液，加入硫酸亞鐵和過氧化氫溶液各2.0 mL，靜置10分鐘后，加入2.0 mL水楊酸，30 min后測定吸光度（510 nm）。對照品溶液中用蒸餾水代替水楊酸測量吸光度，其他樣品按照上述方式測定樣品吸光度計算清除率，用抗壞血酸作為對照。

1.6 主要成分的測定

皂苷的測定：采用香草醛-高氯酸比色法[16-17]測定三七葉總皂苷含量，黃酮的測定：采用三氯化鋁法[18]測定三七葉黃酮的含量，多酚的測定：采用福林酚試劑法[19]測定三七葉中的多酚含量。

2 結果與分析

2.1 不同發酵條件對三七葉活性成分的影響

2.1.1 殺青方式對三七葉中活性物質的影響

不同殺青方式對三七葉中活性物質含量的影響見圖1。

由圖1可知，炒青和蒸青處理對三七葉發酵茶中皂苷、黃酮和多酚含量均有顯著性影響（p＜0.05）。通過兩種不同殺青方式，三七葉發酵茶中活性物質都在5～10 d內出現含量增加，隨著發酵時間的繼續延長，其各成分含量均出現較大程度降低，在發酵15 d時含量達到最低，然后繼續發酵含量又會有一定提高，這可能是三七葉茶經黑曲霉發酵后，隨著發酵進行，黑曲霉代謝逐漸旺盛，會消耗原料中的化學成分，加上在發酵過程中微生物產生多種胞外酶，三七葉中的皂苷、黃酮和多酚均會被氧化而導致含量下降。三七葉通過炒青和蒸青后發酵10 d，蒸青處理過的發酵茶皂苷含量和多酚含量略高與炒青處理的，而炒青過的發酵茶黃酮含量高于蒸青的。結合感官評價，炒青處理溫度較高，能帶來較多美拉德褐變反應的色澤加深和豐富的香氣成分產生的有利結果，故殺青選擇炒青方式較好。

2.1.2 溫度對三七葉中活性物質的影響

發酵溫度對三七葉中活性物質含量的影響見圖2。

由圖2可知，溫度對三七葉發酵茶發酵過程中的化學成分有很大的影響，不同發酵溫度對三七葉皂苷、黃酮有顯著性差異（p＜0.05）。隨著溫度的升高，其皂苷和黃酮含量呈先上升下降，在發酵溫度為30 ℃時三七葉發酵茶中皂苷和黃酮含量顯著高于其他溫度下的含量（p＜0.05），在發酵溫度為40 ℃時皂苷含量達到最低，而多酚含量隨著溫度的升高而緩慢增加，但上升的幅度并不大，這可能是由于40～45 ℃溫度過高，部分黑曲霉死亡，引起多酚氧化的程度減少使得多酚含量增加，綜上可知，溫度為30 ℃時為最適發酵溫度。

圖2 不同發酵溫度對三七葉發酵茶活性物質含量的影響

2.1.3 發酵時間對三七葉中活性成分的變化影響

發酵時間對三七葉中活性物質含量的影響見圖3。

由圖3可知，不同的發酵時間對三七葉發酵茶發酵過程中的化學成分有極大的影響，發酵時間對三七葉皂苷、黃酮有顯著性差異（p＜0.05）。隨著發酵時間的的延長，其皂苷、黃酮含量也隨之增加，與未發酵的三七葉相對比，發酵后的茶葉的皂苷和黃酮含量都高于未發酵茶葉的皂苷含量，并在發酵第15天時皂苷和黃酮含量均達到最大，這可能是由于經過黑曲霉發酵后，原生苷的含量降低，而極性較低的稀有皂苷含量大幅度升高，導致了在發酵過程中皂苷含量不斷變化[21]；三七葉茶在發酵過程中黑曲霉中的微生物消耗了三七葉茶中部分蛋白質和淀粉，次生代謝產物損失較少，從而三七葉發酵茶中黃酮含量增加；而三七葉發酵茶中多酚含量呈現一種先減少后趨于平穩的狀態，與未發酵時茶葉的多酚含量相對比，發酵后茶葉的多酚含量普遍低于未發酵茶葉的多酚含量，從發酵第10天以后變化不大，綜上可知，發酵時間為15 d時為最適發酵時間。

圖3 不同發酵時間對三七葉發酵茶活性物質含量的影響

2.1.4 接種量對三七葉中活性成分的變化影響

接種量對三七葉中活性物質含量的影響見圖4。

由圖4可知，接種量對三七葉發酵茶發酵過程中化學變化有較大影響，接種量與三七葉發酵茶中皂苷、黃酮、多酚有顯著性差異（p＜0.05）。隨著接種量的升高，其皂苷含量也不斷上升，接種量越高，皂苷含量越高，在接種量為33%時，皂苷含量達到最高，這可能是因為隨著黑曲霉數量的增多，極性較低的稀有皂苷含量不斷增多所致；其黃酮含量隨著接種量的升高先緩慢上升后又下降，在接種量為20%時出現最大值，從接種量為27%時開始下降，并在接種量為33%時出現最小值；多酚含量也呈現先上升后下降再上升的趨勢。這可能是三七葉茶在發酵過程中黑曲霉中的生長與接種量有關，也與底物成分、代謝物的反饋調節有關，發酵過程中消耗了三七葉中部分蛋白質和淀粉，次生代謝產物損失較少，從而三七葉發酵茶中最后黃酮含量增加。綜合考慮，接種量為20%時為最適接種量。

圖4 不同接種量對三七葉發酵茶活性物質含量的影響

2.1.5 含水量對三七葉中活性成分的變化影響

含水量對三七葉中活性物質含量的影響見圖5。

由圖5可知，茶坯含水量對于三七葉發酵茶發酵過程中化學變化有一定的影響，含水量與三七葉發酵茶中黃酮呈現顯著性差異（p＜0.05）。隨著含水量的升高，三種活性物質含量均呈現先升高后下降的趨勢，在含水量30%時各含量均最高，黃酮和多酚含量在含水量達50%時又有所增加，這可能是因為水分含量的高低與霉菌的生長和酶的活性水分有關，隨著含水量的升高，原生苷的含量降低，極性較低的稀有皂苷含量大幅度升高，當含水量超過黑曲霉生長的范圍，產生的極性較低的稀有皂苷減少所致；在發酵過程中，三七葉茶中的蛋白質、淀粉成分減少時，微生物利用率降低，黃酮、多酚含量升高。綜合三種化學成分的總體情況來看，含水量為30%時為最適發酵含水量。

圖5 不同含水量對三七葉發酵茶活性物質含量的影響

2.2 三七葉發酵茶抗氧化能力試驗

三七葉中的皂苷、黃酮及多酚類物質均含有大量的酚羥基，可以捕獲自由基生成穩定的半酮式結構，從而終止自由基鏈式反應[20]。通過對不同濃度的三七發酵茶提取液進行清除O2-·和·OH試驗，結果如圖6所示。

圖6 不同質量濃度三七發酵茶的抗氧化活性（A）O2-·（B）·OH

由圖6可知，三七發酵茶提取液質量濃度增加時其清除O2-·和·OH的能力也增強，清除率與三七葉發酵茶提取液的質量濃度呈正相關，在測試的質量濃度范圍內，當質量濃度為0.44 mg/mL時，三七發酵茶對·OH的清除率最高為45.81%。通過回歸計算得到三七發酵茶對O2-和·OH的IC50值分別為1.38和0.65 mg/mL，表明三七葉發酵茶清除O2-·和·OH抗氧化能力良好。

3 結論

試驗以三七葉為原料，接種黑曲霉進行發酵制備三七葉發酵茶，對該發酵茶在制備過程中的殺青方式、發酵溫度、發酵時間、接種量、茶坯含水量與三七葉中活性物質的變化關系進行了研究，結果顯示以上條件對三七葉中皂苷、黃酮和多酚含量均有顯著性影響（p＜0.05），綜合考慮各成分變化情況，三七發酵茶適宜采用炒青進行殺青，在茶坯含水量為30%、黑曲霉接種量為20%、溫度為30 ℃條件下發酵15 d，有利于得到品質較高的三七葉發酵茶，對于發酵制得的三七葉茶，表現出良好的抗氧化能力。