皺皮木瓜內在物質含量及其與土壤環境因子的相關性

徐廣，任星宇，羅川，譚秋生，鄧才富,羅敏

重慶市藥物種植研究所 中藥材質量控制研究中心，重慶市道地藥材規范化生產工程技術研究中心（重慶 408435）

皺皮木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥近成熟果實，主要分布于我國安徽、山東、湖北、貴州、四川和重慶等地[1]。木瓜藥用歷史悠久，始載于《名醫別錄》，列為中品，本品味酸，性溫，歸肝、脾經，具有平肝舒筋、和胃化濕之功。臨床多用于濕痹拘攣、腰膝關節酸重疼痛、吐瀉轉筋、腳氣水腫等癥的治療[2]。現代研究表明，皺皮木瓜是一種集藥用、食用和觀賞于一身的營養豐富的百益果，富含超氧化歧化酶（SOD）[3]。

中藥材質量受產地、生長年限、生長環境以及采收期等眾多因素影響，質量穩定性會出現較大差異[4-7]。目前對木瓜化學成分、質量控制、含量測定及藥理作用研究報道較多[8-10]，但對其品質差異與主要生長環境因子相關性的研究報道較少。隨著近年來農村特色產業結構調整力度加大，木瓜作為藥食兩用品種在發展中備受推崇，因此研究木瓜生長環境對其內在物質含量的影響，揭示環境因子與其內在物質相關性，對皺皮木瓜產地適宜性具有科學的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

項目團隊于2017年對重慶不同生態環境木瓜進行調查采樣，采集了不同種植區的木瓜樣品及對應植株冠幅范圍內10～30 cm層次土壤樣品，風干粉碎過0.850和0.150 mm篩，備用。采集樣品信息見表1。采樣時隨機選取3個地塊，每個地塊分別隨機選取3株取樣然后混合，作為一組樣品。采回的木瓜樣品分別投入90～100 ℃開水中，觀察木瓜表皮開始泛白立即撈起，然后切2～3 mm厚的薄片，于45 ℃烘干打粉，過0.250 mm篩，備用。木瓜藥材和土壤樣品編號一一對應。木瓜樣品均由重慶市藥物種植研究所鄧才富研究員鑒定，為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles spediosa（Sweet）Nakai的果實。

表1 樣品信息

1.2 儀器和試藥

LC-20AT高效液相色譜儀（島津）；KQ-1000DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機（德國，eppendorf）；UV-2450紫外分光光度計（島津）；SPX-400-Ⅱ恒溫培育箱（上海龍躍儀器設備有限公司）；METTLERAL104電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；火焰光度計（上海 FP6410）。

色譜純甲醇（成都科龍化工生產，批號：20130115），熊果酸、齊墩果酸對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號分別為110742-201622和110709-201607），甲硫氨酸（Met），黑黃素，氯化硝基四氮唑藍（NBT），聚乙烯吡咯烷酮（PVP），磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）、重鉻酸鉀、NaHCO3、NH4OAc、甲醇、冰醋酸均為分析純。

1.3 木瓜內在物質含量測定

熊果酸和齊墩果酸總含量測定：取約0.5 g皺皮木瓜樣品細粉，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 KHz）20 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補重，搖勻，過濾，取續濾液進行HPLC分析。色譜條件：色譜柱，SHISEIDO CAPCELL PAK C18MGⅡ色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動相，甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（265∶35∶0.1∶0.05，V/V）；檢查波長210 nm；流速0.6 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

浸出物含量測定：取約2.0 g皺皮木瓜樣品細粉，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL乙醇，密塞，稱定質量，靜置1 h后連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h，放冷，再稱定質量，用乙醇補重，搖勻，過濾，精密量取25 mL濾液，置于干燥至恒重的蒸發皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，放冷，迅速精密測定質量，以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的含量（%）。

1.4 木瓜SOD活性測定

1.4.1 SOD提取

稱取0.5 g鮮木瓜部位于預冷的研缽中，加2 mL提取介質（50 mmol/L磷酸緩沖液含1%的PVP），在冰浴條件下研磨成均漿，加入提取介質沖洗研缽2～3次，并使最終體積為10 mL，取5 mL均漿液在4 ℃條件下按10 000 r/min離心15 min，上清液即為SOD粗提液。

1.4.2 酶活性的測定

采用氮藍四唑光還原法[3]，測定560 nm下的吸光度來計算SOD活性，以抑制NBT光還原反應50%所需的酶量為一個酶活性單位。反應體系：Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液50 mmol/L pH 7.8；130 mmol/L Met用磷酸緩沖液配制；750 μmol/L NBT用磷酸緩沖液配制；20 μmol/L核黃素用磷酸緩沖液配制；100 μmol/L EDTA-Na2用蒸餾水配制。

式中：A0為光下對照管吸光度；AS為樣品測定管吸光度；Vt為樣品提取液的總體積，mL；VS為樣品測定取樣體積，mL；t為光照反應時間，min；FW為鮮品質量，g。

1.5 土壤養分含量的測定

土壤理化性質指標測定主要參照鮑士旦主編的《土壤農化分析》中的方法。采用重鉻酸鉀容重法測定土壤有機質；采用堿解擴散法測定堿解氮；采用0.5 mol/L NaHCO3-鉬銻抗比色法測定速效磷；采用NH4OAc浸提-火焰光度法測定速效鉀。

1.6 數據分析

采用Excel進行數據處理，SPSS 17.0進行方差分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質分析

2.1.1 土壤質地與海拔

如表1所示，采樣點海拔從377 m到1 349 m等不同海拔均有木瓜種植分布，說明其種植范圍海拔跨度較大。采樣點的土壤類型有紫色土、紫色夾沙土、紫黃泥、紫色石骨子土、紫色夾沙泥、紫色大土、礦子黃泥、灰包土、棕紫泥、黃泥等10種類型，表明木瓜種植區域廣，深受百姓喜愛。

2.1.2 土壤化學性狀

如表2所示，所有采樣點的pH范圍在4.60～8.05之間，土壤從酸性到微堿性跨度大。有機質處于0.99～ 5.665 g/kg之間，平均值為2.623 g/kg，屬于六級，肥力比較貧瘠，說明皺皮木瓜在肥力比較貧瘠的土壤中能正常生長。

表2 土壤理化性質

土壤中氮、磷、鉀的含量范圍分別是68.82～ 434.4，1.6～27.675和68.935～561.67 mg/kg；氮和鉀含量處于1～4級之間，磷含量處于2～6級之間，土壤養分分級跨度大，說明皺皮木瓜對土壤養分需求不嚴格，適應性強。同時可以看出，變異系數最大的是速效磷，達0.95，其次是速效鉀、堿解氮、有機質，變異系數分別為0.56，0.48和0.41，pH變異系數最小，為0.15。

2.2 皺皮木瓜內在物質含量分析

表3 皺皮木瓜內在物質含量

指標成分（熊果酸和齊墩果酸）處于0.587%～ 1.552%之間，均超過藥典標準要求的不低于0.50%，其中19，23和24號樣品的熊果酸含量低于齊墩果酸含量，而其他樣品均是熊果酸含量大于齊墩果酸含量；浸出物處于35.15%～50.0%之間，也均超過了藥典標準15%的要求；同時其SOD活性都很高，最低活性1 385.38 U，最高活性1 503.33 U。方差分析表明：不同采樣點木瓜的熊果酸和齊墩果酸的含量存在顯著的差異（p＜0.05）。

2.3 相關性分析

2.3.1 生長環境因子分析

對海拔、土壤pH和N、P、K含量進行了因子分析，提取了3個因子，總方差77.61%的貢獻來自這3個因子，見表4。生長因子分析散點圖見圖1。磷、pH與第一因子有較強相關性，氮、有機質與第二因子有較強相關性。說明土壤養分對皺皮木瓜的內在物質含量有重要影響。

表4 因子分析總方差分解表

圖1 生長因子分析散點圖

2.3.2 生長環境與皺皮木瓜內在物質相關性分析

皺皮木瓜內在物質與生長環境相關性見表5。結果顯示，皺皮木瓜浸出物含量與土壤中堿解氮含量呈顯著正相關（p＜0.05），相關系數為0.486；齊墩果酸含量與生長海拔呈顯著正相關（p＜0.05），相關系數為0.487；SOD與土壤中速效鉀含量呈顯著正相關（p＜0.05），相關系數為0.410。

表5 生長環境與木瓜內在物質相關性分析

2.4 回歸模型的建立

為建立皺皮木瓜質量品質與生長環境因子關系的數學模型，試驗以熊果酸（Y1）、齊墩果酸（Y2）、浸出物（Y3）、SOD（Y4）為因變量，以生長環境因子氮（X1）、磷（X2）、鉀（X3）、pH（X4）、有機質（X5）、海拔（X6）為自變量進行逐步回歸分析，得方程（2）～（4）：

由回歸方程可以看出：對皺皮木瓜齊墩果酸的含量影響最大為海拔高度，二者有顯著的正相關關系；土壤堿解氮與皺皮木瓜浸出物含量有顯著的正相關關系；土壤速效鉀和海拔高度與皺皮木瓜SOD活性呈現顯著的正相關關系。研究結果表明，在較高海拔條件下，有利于某些內在物質的合成或累積，同時在生產中適當增加氮、鉀肥的施用有助于內在物質的累積提升。

3 討論

植物次生代謝產物往往是在多種環境脅迫下通過某些機制調控產生的，土壤是植物賴以生長的物質基礎，其理化特性對植物的生長發育及其次生代謝產物的積累都有影響。研究環境因子與藥材質量之間的相關關系，對于指導開展中藥區劃和規范化種植等具有重要意義。

皺皮木瓜作為食藥兩用的木本樹體，還具有很高的生態價值，適宜的土壤類型多，海拔跨度大，生長環境多樣性，適應性強。此次試驗的因子分析中，磷、pH與第一因子有較強相關性；氮、有機質與第二因子有較強相關性。生長環境因子與內在物質相關性表明，木瓜浸出物含量與土壤中堿解氮含量呈顯著正相關（p＜0.05），齊墩果酸含量與生長海拔呈顯著正相關（p＜0.05），SOD與土壤中有效鉀含量及海拔呈顯著正相關（p＜0.05）；土壤養分對皺皮木瓜生長有重要影響，而變異系數越小，土壤養分越穩定、越均勻，對植物生長影響越大；變異系數：速效磷＞速效鉀＞堿解氮，同時也印證了上述中“堿解氮和速效鉀對其內在物質含量的生成有顯著正相關作用”的結論。進一步證明皺皮木瓜基地的建設特別需要注意考察土壤氮素和鉀素的可供給性，或是在生產中注意氮肥和鉀肥的合理施用。因此在實際的生產布局中，可結合具體的藥用和食用飲品開發分類布局基地，以藥用為主的基地建設，在選址上應更側重于浸出物含量、熊果酸和齊墩果酸等指標成分的有效積累；以化工、食用飲品開發為主的基地建設，則可更側重于功能性成分SOD含量更高的區域布局。