五碳雙縮醛鑒別試驗方法的改進

周曉晴，呂小麗，趙淑娟，張文中，郭平，匡佩琳

江西省食品檢驗檢測研究院（南昌 330001）

五碳雙縮醛（又名戊二醛），英文名glutaraldehyde，化學式是C5H8O2，為無色或淺黃色的透明液體，有特殊刺激氣味，可與水、乙醇以任何比例混合，溶液呈弱酸性。其分子結構式如圖1所示。五碳雙縮醛被廣泛應用于殺菌消毒劑、固定劑、鞣革劑、木材防腐劑、藥物和高分子合成原料等[1-2]，在食品行業可作為食品工業用加工助劑，其在GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中被列作為交聯劑，用于膠原蛋白腸衣的加工工藝[3]。

圖1 五碳雙縮醛結構式

國內外五碳雙縮醛的工業化合成主要路線是以丙烯醛和乙烯基醚加成得2-乙氧基-3,4-二氫吡喃，水解得到戊二醛的吡喃法[4-5]。五碳雙縮醛作為一種食品添加劑，對五碳雙縮醛進行鑒別試驗，對規范國內生產和銷售具有重要的現實意義。

國家衛生健康委（原衛生部）食品添加劑指定標準《食品添加劑 五碳雙縮醛（又名戊二醛）》（2012年第6號）中五碳雙縮醛鑒別試驗方法為：取20 mL 2,4-二硝基苯肼試劑，加入0.4 mL樣品，搖勻，靜置5 min，收集沉淀，用乙醇徹底洗滌，用20 mL熱二氯乙烯溶解沉淀，過濾。濾液經冰浴冷卻至產生結晶，過濾后收集沉淀，用30 mL丙酮回流再溶解，過濾，濾液經冰浴冷卻重結晶，過濾，收集沉淀，所得的2,4-二硝基苯腙測定其熔點為185～195 ℃[6]。《美國食品化學品法典》（第十一版）（FCC 11）中五碳雙縮醛鑒別試驗和美國藥典41（USP 41）中濃戊二醛溶液鑒別試驗均為熔點測定[7-8]。其試驗原理為五碳雙縮醛與2,4-二硝基苯肼反應生成2,4-二硝基苯腙沉淀，且2,4-二硝基苯腙具有特定的熔點。

在檢驗方法研究工作中發現國家衛生健康委（原衛生部）指定標準存在以下2個問題：一是根據標準方法采用二氯乙烯進行溶解上一步生產的沉淀，發現延長溶解時間，提高溶解溫度，二氯乙烯都不能溶解沉淀，更不能再下一步生產結晶；二是標準方法中重結晶關鍵點細節描述不詳細，僅說明用30 mL丙酮回流再溶解，過濾，濾液經冰浴冷卻重結晶，導致試驗重現性差。為此，對五碳雙縮醛鑒別試驗方法進行分析研究，并對該鑒別方法提出改進意見。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2,4-二硝基苯肼、硫酸、無水乙醇（均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；二氯乙烷（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；丙酮（分析純，西隴科學股份有限公司）；定性濾紙[通用電氣生物科技（杭州）有限公司]。

1.2 儀器和設備

QUINTIX124-1CN電子天平（感量0.0001 g，德國賽多利斯公司）；HH-6水浴鍋（上海博訊實業有限公司）；Vortex Wizard渦旋混合器（意大利VELP公司）；WRR-Y熔點儀（上海物理光學儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 二氯乙烷重結晶步驟確定

經過重新比對《美國食品化學品法典》（第十一版）（FCC 11）原文發現《食品添加劑 五碳雙縮醛（又名戊二醛）》（2012年第6號）方法的溶解試劑可能存在錯誤，實際應為二氯乙烷。

1.3.1.1 溶解溫度確定

《美國食品化學品法典》（第十一版）（FCC 11）原文中只寫了熱二氯乙烷，而沒有標注具體溫度。根據二氯乙烷沸點83.5 ℃，同時根據重結晶的原理，在熱的溶劑中溶解，冰浴時析出晶體的原理，溫度越高，溶解性越好，所以為更多地溶解乙醇洗滌后的沉淀，選擇接近沸點的溫度80 ℃。

1.3.1.2 溶解方式確定

為保證二氯乙烷和沉淀一直保持在熱的狀態，溶解過程一直把離心管置于80 ℃水浴中，同時為增大溶液與固體的接觸頻率，增大溶解度，采用邊渦旋邊溶解的方式（每隔5 min渦旋1次）。

1.3.2 丙酮回流重結晶步驟確定

1.3.2.1 回流溫度確定

《美國食品化學品法典》（第十一版）（FCC 11）原文和《食品添加劑 五碳雙縮醛（又名戊二醛）》（2012年第6號）方法中只描述“丙酮回流”，對于回流溫度沒有描述。根據丙酮的沸點56.5 ℃，選擇丙酮回流溫度60 ℃。

1.3.2.2 回流時間確定

隨著加入的二氯乙烷濾液結晶量的增加，丙酮回流后形成的結晶量也增加，但當加入量達0.15 g以上時增長速度減慢。加入二氯乙烷重結晶沉淀0.15 g左右時，回流2 h，沉淀幾乎完全溶解，所以確定回流時間為2 h。

1.3.2.3 丙酮回流時圓底燒瓶內外液面高度確定

在丙酮回流試驗過程中發現回流時如果圓底燒瓶內液面的高度低于水浴鍋中水（外液面）的高度，會造成圓底燒瓶的粘壁現象，直接導致后續無法形成結晶。內液面高于外液面則不會出現粘壁現象，后續可以形成結晶。

2 結果與分析

建議將《食品添加劑 五碳雙縮醛（又名戊二醛）》（2012年第6號）鑒別試驗方法修訂為：取0.4 mL試樣，加入到20 mL 2,4-二硝基苯肼溶液中，搖勻，靜置5 min。過濾，用200 mL無水乙醇徹底洗滌，待乙醇自然揮干后收集沉淀于50 mL離心管中，加入20 mL 80 ℃二氯乙烷溶解沉淀，該溶解過程一直保持在80 ℃水浴中，并每隔10 min渦旋1次，溶解1 h后，趁熱過濾。濾液經冰浴冷卻至產生結晶，過濾后收集沉淀于100 mL圓底燒瓶中。在圓底燒瓶中加入30 mL丙酮，于60 ℃水浴回流2 h再次溶解沉淀，回流時要保證水浴鍋的液面低于圓底燒瓶中丙酮的液面，同時每隔一段時間輕微搖晃圓底燒瓶，避免粘壁。回流后，過濾，收集濾液于50 mL比色管中，將比色管置于冰浴中冷卻重結晶，過濾，收集沉淀，測定所得結晶的熔點。對優化后的鑒別試驗方法進行方法學驗證，主要驗證其精密度和重復性。

2.1 精密度試驗

準確吸取0.4 mL測定用樣品，按改進后的方法連續測定6次，計算其標準偏差和相對標準偏差，結果如表1所示。

由表1可知，標準偏差為0.80，相對標準偏差為0.42%，說明試驗方法的精密度較高。

表1 精密度的測定結果

2.2 重復性試驗

取6份五碳雙縮醛樣品，按改進后的鑒別試驗方法進行測定，結果如表2所示。

表2 重復性的測定結果

從測定結果來看，相對標準偏差為1.10%，其重復性符合試驗要求。

2.3 五碳雙縮醛鑒別的應用

選取6家公司13個市售五碳雙縮醛樣品，采用改進后的方法進行鑒別分析，鑒別試驗結果如表3所示。

表3 市售五碳雙縮醛鑒別結果

從樣品測定結果來看，使用優化后的方法步驟，不會出現難結晶的情況，試驗重現性好，可有效鑒別五碳雙縮醛。

3 結論

試驗方法對國家衛生健康委（原衛生部）食品添加劑指定標準《食品添加劑 五碳雙縮醛（又名戊二醛）》（2012年第6號）中五碳雙縮醛的鑒別試驗方法進行改進優化。替換使用二氯乙烷進行重結晶步驟，確定二氯乙烷重結晶步驟中的溶解溫度80 ℃，并采用邊渦旋邊溶解的方式溶解沉淀。優化丙酮回流重結晶步驟，確定丙酮回流溫度60 ℃，回流時間2 h，回流時圓底燒瓶內液面應高于外液面。方法學試驗和樣品測定結果表明，采用優化后的鑒別試驗步驟易于操作進行，提高了試驗的精密度及重現性，可用于日常五碳雙縮醛樣品中五碳雙縮醛的鑒別測定。