復合酶固定化技術提取革胡子鯰下腳料中的磷脂酰膽堿

劉雪凌，陳旭華，牛麗紅

1. 燕京理工學院（三河 065201）；2. 中國農業科學院農產品加工研究所（北京 100193）

在工業中，使用固定化復合酶提取磷脂酰膽堿比較少見。固定化酶技術的使用，不但可以提高酶的使用效率，而固定化酶還可以重復利用，減少資源消耗，降低磷脂酰膽堿的造價。此次試驗根據之前研究結果及實驗室條件，以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯劑固定化復合酶，從粉碎過的革胡子鯰下腳料勻漿中提取磷脂酰膽堿，考察載體形狀、固定化復合酶加酶量、固定化酶酶解時間及酶解pH對磷脂酰膽堿提取率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

革胡子鯰下腳料（主要為內臟），山東榮信水產食品集團股份有限公司提供；殼聚糖（分析純），山東豫之興生物科技有限公司；戊二醛（分析純），山東嘉穎化工有限公司；磷酸二氫鉀（分析純），天津市北辰方正試劑廠；鉬酸銨（分析純），上海埃彼化學試劑有限公司；對苯二酚（分析純），天津市北方天醫化學試劑廠；乙酸鈉（分析純），天津市致遠化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純），湖北鴻鑫瑞宇精細化工有限公司；無水乙醇（分析純），天津市恒興化學試劑有限公司；鹽酸（分析純），廊坊市金海化工有限公司；氫氧化鈉（分析純），天津成金化工銷售有限公司。

1.2 儀器與設備

FA1004B電子分析天平（上海佑科儀器有限公司）；JJ-2組織搗碎機（金壇市萬華實驗儀器廠）；pH計（煙臺凱米斯儀器有限公司）；HH-6恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；UV-1601紫外分光光度計[北京北分瑞利分析儀器（集團）公司]。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗技術路線

魚下腳料3 g→固定化酶酶解→加入乙醇提取→過濾→提取液→鉬藍比色法測定

鉬藍比色法按GB/T5537—2008進行。

復合酶固定方法：稱取0.2 g殼聚糖于燒杯中，然后加入1%冰醋酸攪拌均勻，分別制成球形、條狀、田字形，倒入固定液（95%乙醇與2 mol/L NaOH按照1∶4配成，V/V），固定化3 h，用去離子水沖洗干凈。將半成品載體在恒溫烘干機中50 ℃干燥1 h，之后加入到用Tris-HCl緩沖液配制的0.05%復合酶溶液中吸附2 h，最后倒入5 mL 50%戊二醛溶液交聯6 h，用去離子水水洗干凈，濾紙吸干[4]，即為固定化復合酶。復合酶為木瓜蛋白酶（添加量為0.04%）、中性蛋白酶（添加量0.03%）、胰蛋白酶（添加量為0.017 5%），另外需添加適量激活劑：標準氯化鈉溶液（添加量0.20%）[5]。

1.3.2 復合酶固定化技術提取工藝的研究

影響復合酶固定化技術提取革胡子鯰魚下腳料中磷脂酰膽堿的主要因素有載體形狀、固定化復合酶酶添加量、固定化復合酶酶解pH、固定化復合酶酶解時間。通過單因素試驗和正交試驗，確定最佳復合酶固定化技術提取磷脂酰膽堿的工藝。

2 結果與討論

2.1 影響固定化復合酶提取魚下腳料中磷脂酰膽堿的因素

2.1.1 載體形狀對磷脂酰膽堿提取的影響

取相同質量的殼聚糖和相同體積的冰醋酸，分別制作球形、條狀、田字形三種形狀固定化復合酶進行提取，并采用游離態的復合酶提取做對照試驗。復合酶添加量均為0.05%。酶解時間為90 min，酶解pH為6，酶解溫度為45 ℃。其結果見圖1。

圖1 載體形狀對磷脂酰膽堿提取的影響

由圖1可知，在酶添加量0.05%，其他試驗條件不變的情況下，田字形載體固定化酶提取率0.761%＞游離態酶提取率0.755%＞條形載體固定化酶提取率0.576%＞球形載體固定化酶提取率0.521%，田字形載體固定化酶的提取率最高。考慮載體取出時的便捷程度與重復利用時方便轉移等因素，選擇田字形載體為最佳載體。

2.1.2 復合酶添加量對磷脂酰膽堿提取的影響

制作田字形載體，載體中固定酶的添加量按梯度分別選擇0.03%，0.04%，0.05%，0.06%和0.07%，酶解時間為90 min，酶解pH為6，酶解溫度為45 ℃，結果見圖2。

從圖2可以看出，酶添加量從0.03%到0.05%的過程中，提取率呈上升狀態，當固定化復合酶添加量為0.05%時，提取率達到最高點1.200%，當酶添加量從0.05%增加到0.07%時，提取率逐漸下降。原因可能是繼續增加酶添加量會使酶相互附著，降低載體上的固定化酶量，進而降低提取率，故0.05%為最佳酶添加量，在接下來的單因素試驗中統一使用。

圖2 復合酶添加量對磷脂酰膽堿提取的影響

2.1.3 固定化復合酶酶解時間對磷脂酰膽堿提取的影響

使用田字形載體，酶添加量0.05%，酶解pH6，酶解溫度45 ℃時，酶解時間按梯度分別選用30，60，90，120和150 min，對魚下腳料進行提取，結果見圖3。

從圖3可以看出，當酶解時間從30 min增加到120 min的過程中，提取率隨著酶解時間的增加而增大，在120 min時達到最高值0.849%，從120 min開始，提取率隨著酶解時間增加而減少。提取時間增加時，磷脂酰膽堿和酶均會因為氧化而變質，而且過長的反應時間會使酶鈍化失活，導致提取率的下降。所以酶解時間取最優值為120 min，并在接下來的單因素試驗中統一使用。

圖3 固定化復合酶解時間對磷脂酰膽堿提取的影響

2.1.4 酶解pH對磷脂酰膽堿提取的影響

制作好田字形載體，統一使用0.05%的酶添加量和120 min酶解時間。酶解pH則按梯度分別調成4，5，6，7和8，其他提取過程均相同，結果見圖4。

圖4 酶解pH對磷脂酰膽堿提取的影響

從圖4可以得到，pH從4到5時提取率急速上升，當pH為5時提取率達到最大值0.856%，而當pH繼續增大時，一直對應的提取率開始緩慢下降。復合酶的本質是蛋白質，pH過高或過低均會使蛋白質變性失活。故其最優pH為5。

2.1.5 固定化酶的使用次數對磷脂酰膽堿提取的影響

準備好田字形載體，試驗條件設為酶添加0.05%量、酶解時間120 min、酶解pH 5，重復利用同一固定化復合酶多次，結果見圖5。

圖5 固定化酶使用次數對磷脂酰膽堿提取的影響

由圖5可知，第一次使用時提取率最高，以后每次重復使用時，提取率都比上一次使用時降低0.005%～ 0.007%，而重復使用到第8次的時候，提取率已經不足第一次使用的一半。從成本和提取效率考慮，一份固定化酶使用4～5次為最佳。

2.2 用固定化復合酶提取革胡子鯰下腳料中磷脂酰膽堿的最佳工藝確定

根據單因素試驗結果，選用乙醇作為提取溶劑，載體為田字格形狀，提取溫度為45 ℃，對（A）固定化復合酶添加量（0.04%，0.050%和0.06%）、（B）固定化復合酶酶解pH（5，6和7）、（C）固定化復合酶酶解時間（60，90和120 min）3個因素在3個水平上進行優選，采用L9(33)進行正交試驗，結果見表1。

由表1可知，從極差R值看，對提取率的影響大小次序為固定化復合酶解pH（B）＞固定化復合酶解時間（C）＞固定化復合酶添加量（A），由此可見固定化復合酶解pH為提取魚下腳料中磷脂酰膽堿試驗中最顯著的影響因素。由表1還可知，固定化復合酶提取魚下腳料中磷脂酰膽堿試驗最佳組合條件為A2B1C2，即酶添加量為0.05%，酶解pH為5，酶解時間為90 min。

表1 正交試驗結果

3 結論

通過對固定化復合酶解技術提取魚下腳料中的磷脂酰膽堿的研究，得出如下結論：

1) 載體的形狀對于固定化復合酶的提取效率有著顯著影響，從復合酶在載體上的吸附面積和固定化酶與原料的接觸面積、易于取出等幾個方面共同考慮，經過試驗，得出結論：在相同條件下，田字形載體固定化復合酶提取效率最高，更易于取出與重復使用。

2) 經過單因素試驗，分別從復合酶添加量、酶解pH、酶解時間三個方面研究固定化復合酶提取魚下腳料中的磷脂酰膽堿的影響因素，最終得出結論：固定化復合酶最適酶添加量為0.05%，最適pH為5，最佳酶解時間為120 min。

3) 通過三因素三水平的正交試驗，可以得出結論：固定化復合酶的最適加酶量為0.05%，最適pH為5，最佳酶解時間為90 min。

4) 由載體重復利用試驗可知，每個載體重復利用至第8次或第9次時，提取率才會降低至第一次使用時一半。

5) 經過簡單的成本核算，一個酶添加量為0.05%的田字形固定化酶提取率約為相同質量無載體酶的5～6倍，雖然成本是其4～5倍，但從試驗結果來看，固定化酶技術比傳統的酶解法提取磷脂酰膽堿更加高效環保。

從試驗來看，固定化復合酶技術在很多方面都優于其他技術，未來必將有廣闊的市場前景。