酶法提取木槿花多糖工藝

劉涵，李咪，孫盼盼，王靜，曹際云

德州學院生命科學學院（德州 253023）

木槿（Hibiscus SyriacusL.）屬錦葵科木槿屬落葉灌木，又名木錦、籬障花。木槿花的食用歷史悠久，在我國廣東、福建等地多作為蔬菜原料烹飪成菜肴。在福建省汀州市，人們用木槿花和蔥切碎，與面粉混合后制成稀面，在煎鍋中油炸后面餅香脆可口，被稱為“面花”和“花炸”。木槿花的營養價值極高，不僅有蛋白質、脂肪、氨基酸、多糖等成分，還有人體所需的微量元素，如鈣、鎂、鐵、鋅、鉀等[1]。木槿花的功效在一些藥物學著作中有所記載，如具有清熱、利濕、涼血等[2]功能，能夠幫助預防治療高血壓和心血管疾病，還可以調節人體免疫功能，有抗炎、抗癌癥、抗糖尿病、抗氧化、抗高血壓等[2]作用。

多糖（polysaccharide）在自然界中分布廣泛，是維持生命活動的基本物質之一[3]。試驗已證明多糖具有抗腫瘤、抗氧化劑、抗病毒、降血糖和免疫調節等[4]作用，對人體副作用小。有研究開發一些多糖類的功能性食品以促進身體健康，是食品行業最具前景的領域之一。

國內外對木槿花提取物的研究主要集中在原花青素、總黃酮和多酚類物質上。呂惠卿等[5]通過響應面法建立回歸方程模型，改進木槿花中總黃酮的最佳提取工藝。張雪嬌等[6]利用響應面法改進木槿花多酚提取工藝條件。黃采姣等[7]研究5種類型的木槿花，通過試驗證明木槿花的總酚和總黃酮含量會影響木槿花的抗氧化性。張婕等[8]通過正交試驗研究木槿花的原花青素提取工藝，優化木槿花花青素的最佳提取工藝。對木槿花多糖的提取工藝研究很少，只有利用超聲波來提取木槿花多糖，而利用酶法提取木槿花多糖還鮮見諸報道。

提取植物多糖的工藝有微波提取[9]、超聲波提取[10]、熱水浸提[11]、堿浸提[12]和酶提取[13]等。通過查閱參考文獻后發現超聲波和微波對多糖的組成和活性有較大影響、堿浸提有嚴格的工藝要求，如果超出工藝要求的pH范圍，則可能會導致糖苷鍵在多糖中斷裂。因此，試驗采用酶法提取木槿花多糖。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

石油醚（沸程30～60 ℃）；無水乙醇、氯仿-正丁醇（V∶V=4∶1）、苯酚（均為分析純）；纖維素酶（酶活3 U/mg）；濃硫酸；葡萄糖；白色重瓣木槿花（江蘇省宿遷市沐陽縣長景園林）。

普通的索氏提取器（冷凝管、抽提管、平底燒瓶）；濾紙筒；HHS21-8-8水浴鍋；PL203電子天平；TDZ5-WS低速架自動平衡離心機；UV-5500紫外可見分光光度計；旋轉蒸發儀；恒溫振蕩箱；等。

1.2 多糖得率的計算

試驗采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，這種方法具有快速方便、顯示靈敏的優點。多糖得率按式（1）計算。

式中：C為多糖質量濃度，mg/mL；V為多糖溶液稀釋后總體積，mL；M為樣品質量，g。

1.3 單因素試驗

稱取一定質量的木槿花粉末，加入石油醚，在66 ℃回流提取2 h脫脂，抽濾，在55 ℃烘箱中烘干，在80%乙醇中浸泡12 h除去一些物質，曬干后備用，得到預處理后的木槿花粉末。稱取1 g預處理后的木槿花粉末于錐形瓶中，在一定酶量、反應時間、料液比、溫度下反應，在100 ℃下滅酶15 min。冷卻后進行真空抽濾，收集濾液，用旋轉蒸發儀旋轉蒸發65 ℃減壓。液體冷卻后，加入4倍體積的無水乙醇，在此期間用玻璃棒不斷攪拌，在4 ℃冰箱中放置12 h。在5000 r/min下離心20 min，棄去上清液留下沉淀，再用蒸餾水溶解，加入溶液體積1/4的氯仿-正丁醇溶液（4∶1，V∶V），搖晃15 min，在4000 r/min下離心15 min，棄去中間及下層的物質，得到多糖提取液，定容到100 mL容量瓶后進行稀釋10倍。加入苯酚和濃硫酸，反應后測定吸光度，重復3次。

1.3.1 酶用量對多糖得率的影響

分別稱取4份1 g木槿花粉末置于瓶中，加入40 mL蒸餾水，加入0.05%，0.10%，0.20%和0.30%纖維素酶，在50 ℃下反應2 h，按1.3項下測定多糖得率，確定木槿花多糖提取最佳酶用量。

1.3.2 酶解時間對多糖得率的影響

分別稱取4份1 g木槿花粉末置于瓶中，加入40 mL蒸餾水和0.05%纖維素酶，在50 ℃下分別反應60，90，120和150 min，按1.3項下測定多糖得率，確定木槿花多糖提取最佳酶解時間。

1.3.3 料液比對多得率的影響

分別稱取4份1 g木槿花粉末置于瓶中，加入0.05%纖維素酶，分別加入20，30，40和50 mL蒸餾水，在50 ℃下反應2 h，按1.3項下測定多糖得率，確定木槿花多糖提取最佳料液比。

1.3.4 酶解溫度對多糖得率的影響

分別稱取4份1 g木槿花粉末置于瓶中，加入40 mL蒸餾水和0.05%纖維素酶，在40，50，60和70 ℃下分別反應2 h，按1.3項下測定多糖得率，確定木槿花多糖提取最佳酶解溫度。

1.4 響應面優化試驗

通過分析單因素試驗的結果，得出影響因素的最佳取值范圍，利用Design-Expert 8.0.6軟件設計處理，固定酶解溫度60 ℃，探討影響因素與多糖得率之間的關系，分別設置酶用量、酶解時間、料液比3個水平因素，以1，0和-1進行編碼，優化酶法提取木槿花多糖工藝。

表1 試驗因素與水平取值

2 結果與分析

2.1 葡萄糖曲線

曲線以葡萄糖質量濃度（mg/mL）為橫坐標，以吸光度（A）為縱坐標，得到回歸線方程Y=9.299 5X+ 0.006 4（R2=0.999 8）。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 酶用量對多糖得率的影響

如圖2所示，曲線整體呈先上升后下降趨勢，酶用量0.05%～0.2%，可以發現木槿花多糖得率一直增長，直至0.2%達到最大值，此時木槿花多糖得率為3.12%± 0.09%。繼續加大纖維素酶用量，曲線開始下降，表明木槿花多糖得率開始減少。原因可能是酶用量超過0.2%時，酶分子與全部底物結合，無剩余底物，此時會有剩余的酶，而這些酶會酶解多糖，導致多糖得率下降[23]。因此纖維素酶的最佳酶用量為0.2%。

圖2 酶用量對木槿花多糖得率的影響

2.3 酶解時間對多糖得率的影響

如圖3所示，隨著酶解時間增加，木槿花多糖得率在酶解時間60～120 min之間變化幅度不明顯，在酶解時間120～150 min出現激增，并在酶解時間150 min時，木槿花多糖得率達到3.85%±0.2%，通過參考其他相關文獻猜測多糖得率在酶解時間180 min會出現下降，所以在響應面水平值上設置酶解時間180 min。

圖3 酶解時間對木槿花多糖得率的影響

2.4 酶解溫度對多糖得率的影響

如圖4所示，觀察曲線變化走向，會發現提取率是先增大后減小的。酶解溫度60 ℃時，提取率達到最大，即2.695%±0.11%；酶解溫度增加10 ℃，發現提取率開始減小。這是因為溫度會影響酶反應速度，在最適溫度下酶反應速度會達到最大值，但在低溫或高溫下會導致酶反應速度減慢，甚至會導致酶失活。因此纖維素酶提取木槿花多糖的最佳酶解溫度為60 ℃。

圖4 酶解溫度對木槿花多糖得率的影響

2.5 料液比對多糖得率的影響

如圖5所示，曲線呈現先上升后下降趨勢，料液比1∶40（g/mL）時，提取率最大，即2.688%±0.19%。料液比1∶50（g/mL），提取率開始下降。這是因為：在提取多糖過程中所加溶劑太少，會導致多糖不容易從植物細胞中析出，使得多糖得率下降；隨著溶劑增加，更多的多糖從植物細胞中析出溶解到溶劑中，多糖得率開始上升，但隨著溶劑體積不斷增大，溶劑內酶濃度下降，使得多糖得率又緩慢下降。因此纖維素酶提取多糖的最佳料液比為1∶40（g/mL）。

圖5 料液比對木槿花多糖得率的影響

2.6 響應面優化試驗結果

通過完成單因素試驗，得出影響因素的最佳取值范圍，利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的試驗數據進行分析，得到三元二次回歸方程：Y=5.19+1.13A-0.11B+0.70C+0.27AB-0.055AC+0.16A2+0.46B2-0.77C2。

表2 響應面試驗設計與試驗結果

表3顯示，回歸模型對木槿花多糖得率的影響顯著（p=0.0192＜0.0500），失擬項不顯著（p=0.3929＞0.050），說明模型的擬合程度良好。多糖得率的校正系數R2為70.86%，結果表明得出的模型可以解釋70.86%多糖得率的變化[14]。

通過表3發現，酶用量、酶解時間和料液比的平方項對木槿花多糖得率的影響較大。分析表3中的F值發現，F值越高，對多糖得率的影響越大。由一次項的F值可以看出FA＞FC＞FB，因此可以看出影響得率的大小因素順序為酶用量＞料液比＞酶解時間。使用Design-Expert得到響應面曲線，曲線的分析原理：響應圖的曲面越陡峭，輪廓越密集呈橢圓，表示因素之間交互影響越大[15]，所以由圖6～圖8可以看出，只有酶用量和酶解時間交互作用顯著，對多糖得率影響較大。

圖6 酶解時間和酶用量對多糖得率的影響

圖8 料液比和酶解時間對多糖得率的影響

表3 回歸模型的方差分析

利用軟件分析得到提取木槿花多糖的最佳工藝：酶解時間180 min，酶用量0.3%，料液比1∶48.4（g/mL），預測提取率為7.641%。為驗證進行重復試驗，試驗結果為7.247%，與預期值相差不大，所以利用Design Expert 8.0.6軟件得到的回歸模型可靠，可用于木槿花多糖的提取。

圖7 料液比和酶用量對多糖得率的影響

3 結論與展望

通過單因素試驗，得到影響因素的最佳取值范圍，利用響應面法建立酶提取木槿花多糖的回歸方程模型，改進木槿花多糖的提取工藝。分析后發現影響多糖得率的因素大小順序是酶用量、料液比、酶解時間。

最佳工藝條件為酶用量0.3%、酶解時間180 min、料液比1∶48.4（g/mL）、酶解溫度60 ℃，預測得率為7.641%。通過參考其他文獻發現超聲波提取木槿花多糖得率為6.36%，比較后發現酶法提取木槿花多糖的提取率要比超聲波提取木槿花多糖多1.2個百分點。所以后續研究木槿花多糖的其他特性時，可采用酶法提取木槿花多糖，不僅多糖得率更高，而且節約實驗資源。