山茱萸多糖提取工藝優(yōu)化及對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

任俊鵬，楊志萍，陳貴堂，綦國(guó)紅

中國(guó)藥科大學(xué)工學(xué)院/國(guó)家中藥材加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心（南京 211198）

中藥中常用的山茱萸是山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalisSieb.et Zucc.）的干燥成熟果肉，又名藥棗、萸肉、山萸肉等，主要來(lái)自我國(guó)中部，如山西、河南、湖南等省份，具有補(bǔ)益肝腎、收澀固脫等作用[1]，中醫(yī)中常用于治療糖尿病、癌癥和休克等疾病，含有多糖、三萜、環(huán)烯醚萜、有機(jī)酸、黃酮和鞣質(zhì)等成分。近幾年對(duì)山茱萸多糖的研究主要集中在提取分離和藥理活性方面。山茱萸多糖提取分離常用方法是熱水提取法，此方法時(shí)間長(zhǎng)，能耗高，提取率低。超聲提取法，利用超聲波產(chǎn)生的空化、振動(dòng)、粉碎、攪拌等效應(yīng)破壞細(xì)胞壁，增加溶劑穿透力，提高提取率，縮短提取時(shí)間[2]。

糖尿病（diabetes mellitus，DM）成為嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病之一[3]，患者多以注射胰島素和長(zhǎng)期服用降血糖藥物來(lái)控制血糖。α-葡萄糖苷酶存在于人體小腸黏膜細(xì)胞中，參與人體糖代謝，使碳水化合物分解為易于被人體吸收的單糖，能夠?qū)е绿悄虿』颊卟秃笱巧仙?。?葡萄糖苷酶抑制劑通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-葡萄糖苷酶活性，使碳水化合物緩慢分解為葡萄糖，從而控制糖尿病患者餐后血糖水平。α-葡萄糖苷酶抑制劑是糖尿病人的臨床用藥，多以化學(xué)合成或微生物發(fā)酵法獲得，雖有良好的藥效，但長(zhǎng)期服用毒副作用明顯[4]。因此尋找天然來(lái)源的α-葡萄糖苷酶抑制劑將成為今后糖尿病治療的新思路。試驗(yàn)在超聲輔助提取山茱萸多糖工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究山茱萸多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，考察其降血糖活性的潛質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山茱萸，產(chǎn)地安徽亳州，于60 ℃烘干8 h，粉碎，過(guò)0.180 mm（80目）篩，于-4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

D-無(wú)水葡萄糖（上海凜恩科技發(fā)展有限公司）；苯酚（上海晶純生化科技股份有限公司）；98%硫酸（南京化學(xué)試劑股份有限公司）；α-葡萄糖苷酶（上海源葉生物科技有限公司）；阿卡波糖（上海源葉生物科技有限公司）；對(duì)硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG，北京伊諾凱科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；JY-92IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Elx800多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 山茱萸粗多糖提取工藝流程

一定質(zhì)量的山茱萸粉與蒸餾水按一定比例的料液比置于250 mL錐形瓶中超聲，冷卻后離心（4000 r/min，10 min），取上清液，定容至250 mL，即為待測(cè)液。將待測(cè)液濃縮2.5倍，按1∶4（V濃縮待測(cè)液∶V無(wú)水乙醇）加乙醇沉淀多糖，離心（4000 r/min，10 min），取沉淀，于-50 ℃真空干燥，得到山茱萸粗多糖[5-6]。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照文獻(xiàn)[5]方法以葡萄糖溶液的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.0105X+0.052和相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。

1.3.3 山茱萸粗多糖提取率的測(cè)定

按1.3.2法進(jìn)行測(cè)定，將吸光度帶入回歸方程，得待測(cè)液中多糖質(zhì)量濃度，計(jì)算多糖質(zhì)量，按式（1）計(jì)算山茱萸多糖提取率。

式中：A為待測(cè)液吸光度；0.052為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；0.010 5為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；10為待測(cè)液稀釋倍數(shù)；0.25為待測(cè)液體積，L；3為山茱萸原料質(zhì)量，g。

1.3.4 山茱萸粗多糖提取單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 超聲提取溫度對(duì)提取率的影響

取3.0 g山茱萸樣品，加90 mL蒸餾水，恒定超聲時(shí)間、超聲功率和料液比，測(cè)定溫度分別為40，50，60，70和80 ℃時(shí)山茱萸粗多糖的提取率[5-6]。

1.3.4.2 超聲提取功率對(duì)提取率的影響

取3.0 g山茱萸樣品，加90 mL蒸餾水，恒定超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比，測(cè)定功率分別為400，425，450，475和500 W時(shí)山茱萸粗多糖的提取率。

1.3.4.3 超聲提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

取3.0 g山茱萸樣品，加90 mL蒸餾水，恒定超聲功率、超聲溫度和料液比，測(cè)定超聲時(shí)間分別為20，30，40，50和60 min時(shí)山茱萸粗多糖的提取率[5-6]。

1.3.4.4 超聲提取料液比對(duì)提取率的影響

取3.0 g山茱萸樣品，恒定超聲功率、超聲溫度和超聲時(shí)間，測(cè)定料液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL）時(shí)山茱萸粗多糖的提取率。

1.3.5 山茱萸粗多糖提取正交試驗(yàn)

在4個(gè)單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，從每個(gè)單因素的5個(gè)水平中選取3個(gè)水平。以粗多糖提取率（%）為考察指標(biāo)，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)，按照L9(34)標(biāo)準(zhǔn)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化山茱萸粗多糖的提取工藝條件。

1.3.6 山茱萸粗多糖提取的驗(yàn)證試驗(yàn)

分別稱取3份3.0 g山茱萸樣品，按照正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)得出的超聲提取的最佳工藝條件，進(jìn)行提取并計(jì)算粗多糖提取率。

1.3.7 山茱萸粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

按文獻(xiàn)[7]方法，磷酸緩沖液（PBS）pH6.8，α-葡萄糖苷酶濃度0.2 U/mL，底物（PNPG）濃度10 mmol/mL，Na2CO3濃度1 mol/L。加入底物前于37 ℃反應(yīng)20 min，加入底物后于37 ℃反應(yīng)40 min，最后加入Na2CO3溶液終止反應(yīng)，反應(yīng)步驟如表1所示。

表1 PNPG法測(cè)α-葡萄糖苷酶活性步驟參數(shù)

反應(yīng)結(jié)束后于410 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，山茱萸粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率按式（2）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 山茱萸粗多糖提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲提取溫度的確定

如圖1所示，超聲溫度對(duì)提取率影響較大，溫度40～70 ℃范圍內(nèi)多糖提取率隨溫度升高而增加，超聲溫度大于60 ℃時(shí)提取率增長(zhǎng)變緩，70 ℃時(shí)達(dá)到最高，提取溫度大于70 ℃時(shí)提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，最佳提取溫度為70 ℃。

圖1 超聲提取溫度對(duì)山茱萸粗多糖提取率的影響

2.1.2 超聲提取功率的確定

如圖2所示，超聲功率400～475 W范圍內(nèi)，粗多糖提取率隨提取功率升高而增大，在475 W時(shí)提取率達(dá)到最高，然后提取率隨提取功率升高而略有下降。分析其原因：隨著超聲功率升高，超聲波帶來(lái)的空化作用越來(lái)越大，增加山茱萸細(xì)胞壁的破壞程度，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲出加快，山茱萸多糖提取率增大。超聲功率大于475 W時(shí)，空化作用增強(qiáng)使雜質(zhì)含量增加，多糖提取率變化不大，而且功率越大能耗越高。綜合考慮，提取功率選擇475 W。

圖2 超聲提取功率對(duì)山茱萸粗多糖提取率的影響

2.1.3 超聲提取時(shí)間的確定

如圖3所示，超聲時(shí)間10～50 min時(shí)，隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞破碎程度增大，多糖提取率隨之增大，并在50 min時(shí)達(dá)到最大值，提取時(shí)間超過(guò)50 min時(shí)，隨時(shí)間延長(zhǎng)粗多糖提取率略有下降。綜合考慮，提取時(shí)間選擇50 min。

圖3 超聲提取時(shí)間對(duì)山茱萸粗多糖提取率的影響

2.1.4 料液比的確定

如圖4所示，料液比1∶10～1∶30 g/mL時(shí)山茱萸粗多糖提取率呈上升趨勢(shì)，料液比1∶30 g/mL時(shí)，提取率達(dá)最大。隨料液比中液體比例的增加，提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。料液比中液體比例較大時(shí)，溶質(zhì)溶出較快，同時(shí)可能導(dǎo)致溶出雜質(zhì)較多，所以提取率出現(xiàn)波動(dòng)。同時(shí)料液比中液體比例增大會(huì)增加濃縮時(shí)間與能耗，綜合考慮，最佳料液比為1∶30 g/mL。

圖4 料液比對(duì)山茱萸粗多糖提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以粗多糖提取率（%）為考察指標(biāo)，選取超聲溫度（A）、超聲功率（B）、超聲時(shí)間（C）、料液比（D）4個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，按照L9(34)標(biāo)準(zhǔn)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。正交試驗(yàn)因素及水平如表2所示，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)因素及水平

根據(jù)表3中R值（極差）可知，試驗(yàn)考察的影響山茱萸多糖提取率的各因素的次序?yàn)锳＞B＞D＞C，其中A較為顯著，B、D和C為一般顯著性水平。通過(guò)對(duì)表3中K1、K2、K3分析可知，山茱萸粗多糖提取的最佳工藝條件是A1B1C3D2，即超聲溫度60 ℃、超聲功率450 W、超聲時(shí)間50 min、料液比1∶30 g/mL。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)確定的最佳提取工藝條件，即超聲溫度60 ℃、超聲功率450 W、超聲時(shí)間50 min、料液比1∶30（g/mL），進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果分別為30.36%，30.45%和30.48%，平均值為30.43%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為0.21%，試驗(yàn)重現(xiàn)性良好，該提取條件對(duì)山茱萸粗多糖的提取效果較好。

2.4 山茱萸粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

由圖4可知，山茱萸粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用呈量效關(guān)系，10 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)70%，說(shuō)明山茱萸多糖可以有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，具有降血糖的潛質(zhì)。

圖5 山茱萸粗多糖、阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3 結(jié)論與討論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)山茱萸粗多糖的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取條件：超聲溫度60 ℃、超聲功率450 W、超聲時(shí)間50 min、料液比1∶30（g/mL），并在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，山茱萸粗多糖提取率達(dá)30.43%。該提取工藝時(shí)間短，提取率較高，耗能較少。研究表明，不同的提取方法不但影響多糖的提取效率，而且影響多糖的分子量、單糖組成、結(jié)構(gòu)以及生物活性。在多糖提取中，不同提取方法對(duì)同種原料產(chǎn)生效果不同，而超聲輔助提取山茱萸粗多糖，對(duì)結(jié)構(gòu)和活性的改變?nèi)杂写芯俊Ｌ悄虿』颊卟秃笱巧呖梢酝ㄟ^(guò)服用α-葡萄糖苷酶的抑制劑進(jìn)行控制，阿卡波糖是α-葡萄糖苷酶的抑制劑，臨床上常用于治療2型糖尿病導(dǎo)致的餐后血糖升高。對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制試驗(yàn)表明山茱萸粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有較好的抑制作用，10 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)70%，是同濃度下阿卡波糖的79%，為其在降血糖活性方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。